根据斯坦福大学医学院和班纳太阳健康研究所的机构审查委员会和政策，从班纳太阳健康研究所的大脑和身体捐赠计划中获得了冷冻的上额回和梭状回组织块和病理临床报告
。从Banner Sun Health Research Institute获得的所有样品都存储在-80°C ，直到加工为止。Isolation of nuclei from frozen brain tissue: 20–50 mg of flash-frozen human brain tissue isolated from the frontal cortex was thawed in 2 ml of ice-cold homogenization buffer (molecular biology grade water, 260 mM sucrose, 30 mM KCl, 10 mM MgCl, 20 mM tricine-KOH, 1 mM dithiothreitol, 500 μM spermidine,150μm的精子
，0.3％NP-40，蛋白酶抑制剂 ，RNase抑制剂）在预先充满的Dounce均质器中持续5分钟 。用“ A
”松散的杵散发出10杆
，然后用20杆和“ b”紧密的杵散发出来
。将所得的匀浆通过70μm流量过滤器进入了1.5 mL管的预呼吸器。通过在固定角度离心机中的350个相对离心力下4°C的4°C离心5分钟，将核固定5分钟 。除50μL外清（含有胞质RNA）外 ，所有除了移液和核均均置于1×均质化缓冲液中
，将其重悬于400μL的总体积中，并通过移液量轻轻混合并转移至预希式的2 mL 2 ml蛋白质固定管
。通过用400μl重悬的核可以轻轻混合400μl的400μl碘糖溶液（Optiprep Sigma CatalogNo。D1556） ，以制造25％碘二醇溶液 。总共将600μl的30％碘二醇溶液轻轻地分层在含有分离核的25％碘二醇溶液下
，而无需混合碘二醇层
。接下来，将600μl的40％碘糖溶液轻轻地分层在30％碘二醇溶液下方 ，而无需混合碘二醇层， 总体积为2 ml。将样品在4°C下在3,000相对离心力的4°C下在4°C下离心20分钟
，然后将样品离心20分钟 。离心后，使用含有核条带的真空吸入到1 ml的总体积 ，将碘二醇层的顶部1 mL（含有髓磷脂和较大碎屑的溶液）吸入
。从较小的细胞碎片中分离出细胞核
，通过移动前200μl的核层（在30％–40％iodixanol界面中以800μl和1 ml之间的体积为单位）。将总计200μl分离的核在200μl核洗涤缓冲液中稀释（磷酸盐缓冲盐水（PBS），具有0.1％BSA和0.2Uμl-1的RNase抑制剂 。使用Chromium Next Next Single 3''V.1 cornitired cornurers cornurers cornurers contriel cornurers（10'nectire）（SNRNA-SEQ抑制剂）从核中制备SNRNA-SEQ库。使用TC20自动细胞计数器（Bio-Rad） ，并以每样品的浓度为8,000个核
，将13个聚合酶链反应（PCR）循环加载到最终的SNRNA-SEPE Libraries上，以13个循环进行了互补的DNA
。 　　通过使用CellRanger软件（v.4.0.0）（10x Genomics）对准读取与HG38基因组（Refdata-Gex-GRCH38-2020-A）（10X Genomics）来获得原始基因计数。为了说明未填充的核转录本 ，还计算了读取映射到预选前的RNA 。所有后续分析均基于Scanpy42（v.1.9.1）单细胞数据分析软件包在Python（v.3.9.12）中实施
，除非另有说明
。首先使用scrublet（v.0.2.3）Python软件包筛选了数量数据。一旦每个单元格得分，我们就将每个样本的单独的双线分数阈值应用于数据 。根据样品双重分数直方图 ，每个样品在每个样品中识别阈值在0.15至0.5之间（扩展数据图1A）
。然后
，我们按照参考指南应用标准过滤规则。44 。我们使用Scanpy（v.1.9.1）软件包来丢弃（1）少于500个基因或（2）少于1,000个读数或（3）超过10％的线粒体读数或（4）超过10％核糖体读数的细胞
。然后计数为每百万（C.P.M）。缩放和对数均衡，以进行下游分析 。 　　我们合并了样品中的所有数据 ，并使用了Scanpy的标准方法（V.1.9.1）选择了顶部的2,500个高度可变的基因，并计算了前20个主要成分
。用肘法鉴定了先前数量的主组件。然后
，我们使用了BBKNN（V.1.5.1）的Python实现，这是一种适用于大型数据集的快速批次校正算法 ，以整合Samples45的数据 。BBKNN从估算的主组件中计算出批处理校正的图形。我们将各个样本ID设置为批次标签
，以校正潜在的样本批处理效果
。然后，我们使用批处理校正的邻域图来运行leiden clustering46 ，并计算带有默认参数的全局UMAP嵌入（v.1.9.1）。我们使用这些嵌入来注释细胞 。请注意
，BBKNN不会以任何方式修改计数数据，而是返回我们用于著名下游分析的邻里图
。 　　莱顿集群根据特定领域的专业知识对一对一注释。We investigated each Leiden cluster separately on the basis of the expression of common cell-type markers (excitatory neurons, Slc17a7; inhibitory neurons, Gad1; oligodendrocytes, Mog; endothelial cells, Cldn5; astrocytes, Aqp4; microglia, Cd74) and annotated the clusters accordingly.标记基因表达分析在Python（V.3.9.12）和Scanpy（V.1.9.1）中实施 。 　　我们总结了每个患者样本的原始计数 ，因此从单细胞计数中得出了“伪库克 ”样本47
。然后
，我们使用deseq2（参考文献48）在R（v.4.3）中执行批量数据归一化和差异基因表达（DGE）。我们遵循了标准的DESEQ2分析步骤，并在所有APOE4/4 ，APOE3/3和对照样品中进行了测序深度的归一化 。然后
，我们以标准参数进行了DGE分析
。使用标准的“ APEGLM
”方法缩小了所得的对数尺度折叠变化。在每个比较中，我们都从DGE分析中丢弃了用于QC过滤（RB*和MT-*）的基因 ，因为这些基因可能会因质量控制过程而偏见 。每次比较使用Benjamini – Hochberg程序49（错误的发现率（FDR）= 0.05）校正P值
。 　　为了对小胶质细胞进行无偏的单细胞水平分析，而小胶质细胞对任何患者样品均不偏置
，首先，我们用纯化50对小胶质细胞群进行了采样。我们使用了根据前2,000个高度可变基因计算的前20个主要组件作为输入 ，每个单个组中选定的1,000个单元（对照
，AD-APOE3/3和AD-APOE4/4/4） 。 　　我们使用Seurat软件包对R（v.4.3）中的MAST51进行了MAST51的子采样数据进行了DGE分析。我们将性别，过期年龄 ，验尸间隔以及线粒体和核糖体计数的百分比视为协变量
。我们在三个单个组（对照
，AD-APOE3/3和AD-APOE4/4）中进行了（1）成对比较（总共三个），以及（2）在三个带注释的小胶质状态（稳态 ，大坝和LDAM）之间进行的“单次折扣”比较。每次比较用Benjamini – Hochberg程序49（FDR = 0.05）校正P值 。 　　如先前所述3,52
，将亚胶质细胞数据进行标准化
。简而言之，首先从Scanpy软件包的Refress_out函数（v.1.9.1）开始回归 ，从原始计数
，性别，过期年龄 ，验尸间隔和线粒体/核糖体计数的百分比开始。然后，我们基于前2,000个高度可变基因的前20个主组件作为输入
，以在此校正后的小胶质细胞群数据上重复具有Scanpy（V.1.9.1）中默认参数的Leiden聚类和UMAP可视化步骤 。为了表征每个子集群，我们计算了标记基因的平均表达水平（稳态-P2RY12 ，P2RY13
，CX3CR1，TMEM119； DAM -CD9 ，ITGAX
，CLEC7A，CD63 ，SPP1
，SPP1，SPP1 ，SPP1
，LPL，LPL ，LPL，TREM2
，TREM2，APOE； ldam -nampt ，nampt
，acsl1，dpyd ，dpyd
，dpyd，cd163）
。然后 ，我们通过平均每个细胞的最小值归一化表达值来计算签名得分。我们使用这些签名分数来注释子截面
，并将它们映射到UMAP空间，而Scanpy执行了内核密度估计 ，以将它们定位在UMAP空间（单细胞景观）中 。 　　对SNRNA-SEQ处理的邻近组织进行免疫组织化学和免疫荧光
。用剃刀刀片切割来自每个人的前额叶皮层
，并在4°C下直接浸入4％多聚甲醛中24小时。然后将它们转移到1×PBS中的30％蔗糖溶液中，并在4°C下储存 ，直到组织沉入小瓶中 。然后将组织冷冻在OCT化合物中，储存在-80°C下
，并在低温恒温器（Leica CM3050s）上进行切片
。对于油红色O染色，从-80°C冰箱中除去了带有10μM前额叶皮层的载玻片 ，并将其带到室温5分钟。首先将载玻片在丙二醇中孵育5分钟
，然后在室温下从ABCAM油红色O染色套件（AB150678）中从ABCAM油红O染色套件（AB150678）中孵育2小时 。将切片在85％的丙二醇在蒸馏水中分化1分钟，在血久氧化物中孵育1分钟 ，并用几种蒸馏水变化冲洗。幻灯片用玻璃盖滑梯和延长金色安装介质密封
。成像是用Zeiss Axioskop 2加显微镜进行的。在ImageJ中量化了每个图像的油红O计数
，我们在Prism9（GraphPad）中进行了统计分析 。对于免疫荧光，将自由浮动的50μm切片在PBST中洗涤3次 ，然后用PBST中的5％驴血清阻塞1小时
。将切片在4°C的PBS中孵育3％的驴血清和以下主要抗体
，在4°C：山羊抗IBA1（1：500; ABCAM，ABCAM ，AB5076）
，兔抗ACSL1（1：100; Thermo Fisher PA5-78713）和抗β-AmyloId（1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：500）。初级抗体孵育后，将切片在PBST中洗涤3次 ，并在PBS中孵育，并在室温下在以下二次抗体中孵育2小时：驴抗山羊Alexa Fluor 488
，Donkey Antikey Antikey Alti-Rabbit Alexa Fluor 555和Donkey Antkey Antike Antikey Antikey Antike Anti抗Mouse Alexa fluor 647（All alexa fluor 647（All 1：500 nevitr）；将切片在DAPI（1：2,000; Thermo Fisher）中孵育10分钟， 然后用PBST洗涤3次 。将部分安装在带有延长玻璃安装介质的显微镜幻灯片上
。使用Zeiss LSM 900共聚焦显微镜Zen 3.0（蓝色版）软件进行成像。 　　人类APOE3-KI和APOE4-KI小鼠与过表达突变体应用程序（J20系）的小鼠杂交 ，以生成J20/APOE4-KI和J20/APOE3-KI小鼠
，如我们前面报道的15 。所有鼠标线都保持在C57BL/6 J背景上
。性别和年龄匹配的野生型小鼠用作对照。在13个月大时，从雌性J20/APOE4-KI和J20/APOE3-KI小鼠（每组n = 3）收集大脑 。如前所述 ，从固定的右半核能上收集了脑切片（30μm）
，该滑动型右半纤维，如前所述
。将自由浮动的30μm切片在PBS中洗涤3次 ，然后用PBS中的10％驴血清阻塞1小时。将切片在PBS中孵育5％驴血清和IBA1初级抗体（1：500; Wako 019-19741）在4°C下孵育72小时 。初级抗体孵育后
，将切片在PBS中洗涤一次，并在室温下在接下来的二抗染料中孵育2小时：驴抗兔555（1：500; Invitrogen）和Lipidspot 488（1：1000; Biotium; Biotium）。将切片在DAPI（1：2,000; Thermo Fisher）中孵育10分钟 ，然后用PBS洗涤3次
。将部分安装在带有延长玻璃安装介质的显微镜幻灯片上。使用Zeiss LSM 900共聚焦显微镜Zen 3.0（蓝色版）软件进行成像 。所有动物护理和程序都符合《动物福利法》
，并符合机构指南，并得到斯坦福大学实验室动物护理机构行政小组的批准
。 　　如先前所述 ，生成了等源性APOE4/4和APOE3/3 IPS细胞。IPS细胞保持在STEMFLEX培养基（Gibco，A3349401）中
，并通常将团块转移到Matrigel（Corning，40230）涂层板上 。如先前所述的17,18,19进行了分化为小胶质细胞
。首先使用商业可用的STEMDIFF造血试剂盒（Stemcell Technologies ，05310）根据制造商的说明将IPS细胞分化为造血祖细胞（HPC）。将悬浮液中的HPC转移到含有融合的原发性星形胶质细胞（Thermo Fisher
，N7805100）的板上，其中包含ISCOVE修改的Dulbecco培养基（Thermo Fisher） ，胎儿牛血清（FBS）和青霉素 - 链霉素和20 ng MILF的媒体
，胎儿牛（Thermo Fisher），MILF 。（脱皮技术）持续10天
。收获IMG并转移到稳态培养条件中 ，该条件改编自参考。19（MGDM媒体）在Matrigel（Corning
，40230）涂层板上，在测定前5-15天 。对于涉及显微镜的免疫荧光的测定 ，将IMG的静态培养条件（MGDM培养基）镀在纤连蛋白上（Stemcell
，07159）的涂层板上，以增强细胞粘附
。所有测定均在无血清条件下进行（MGDM培养基）。 　　将洋黄酸或人类巨噬细胞固定在4％多聚甲醛中10分钟 。用PBS洗涤细胞 ，然后在PBS中用5％的驴血清阻塞1小时。将细胞在4°C的PBS中孵育3％的驴血清和以下主要抗体在4°C：兔抗蛋白酶2（1：200; ProteIntech 15294-1-AP），兔抗ACSL1（1：100; Thermo Fisher PA5-78713）
，LC3B（1：1：300鼠标：300鼠标pa 300鼠标，Thermo fisher pa） -抗β-淀粉样蛋白（1：500；细胞信号技术 ，第15126号）
。初级抗体孵育后
，将细胞用PBS洗涤，并在PBS中孵育 ，在室温下孵育2小时：驴抗兔Alexa Fluor 488
，驴抗兔Alexa Fluor 555和Donkey Ankey Antikey Antikey Antikey Antike抗小鼠Alexa Fluor 647（All 1：500 inspogen）。将切片在DAPI（1：2,000; Thermo Fisher）中孵育10分钟，然后用PBS洗涤3次 。然后将在盖玻片上生长和染色的细胞安装在玻璃显微镜载玻片上 ，并用延长的玻璃安装介质安装
。使用Zeiss LSM 900共聚焦显微镜Zen 3.0（蓝色版）软件进行成像。另外
，将细胞固定在96孔板的复制孔中，并通过Incucyte S3分析系统（Essen Bioscience）对成像进行成像并定量 。对于活细胞显微镜 ，将细胞未经处理或用5μMAβ原纤维或10μMGNE-317（SelleckChem
，S7798）处理24小时
。24小时后，更换培养基 ，并将细胞与脂质的488（Biotium，70065-T）与Phrodo Red Zymosan Bioparticle（P35364
，Thermo Fisher）或Lysotracker（L12492，Thermo Fisher）结合使用。对于Aβ原纤维形成 ，如前所述的53形成了单体HFIP处理的Aβ蛋白（1-42）（Bachem目录号4090148） 。每1小时
，使用Incucyte S3分析系统（Essen Bioscience）每1小时获取每孔每1小时每1小时获取四个相对比的绿色和红色荧光图像
。对于每个时间点， 将红色和绿色荧光标准化为每个孔的相汇合。 　　全血是从斯坦福血液中心获得的 。通过在PBS中稀释样品（等效的血液体积）进行外周血单核细胞分离 ，并在Ficoll层的顶部转移（GE Healthcare CatalogNo
。17-5442-02）。然后将管子以400克
，室温，加速度（慢）和制动（慢）离心30分钟 。离心后 ，将上层丢弃
，并在新鲜的50 mL猎鹰管中收集了相间的外周血单核细胞层。将细胞用PBS洗涤两次并计数
。然后根据制造商的说明，使用PAN单核细胞隔离试剂盒（Miltenyi Biotec目录号130-096-537）分离单核细胞。单核细胞在X-Vivo 15无血清培养基（LONZA）中培养 ，并分化为具有20 ng Ml-1的M-CSF（Peprotech）的巨噬细胞 。 　　来自小鼠小胶质细胞系的细胞最初是从IRCCS Azienda ospedaliera Universitaria Universitaria San Martino的Banca Biologica E Cell Factory获得的
。将细胞维持在补充有5％FBS和抗生素的DMEM（生命技术）中（Penicillin 100 U ML -1
，链霉素100 U ML -1（GIBCO），10 mM谷氨酸（Gibco）在标准培养条件下（GIBCO）在标准培养条件下（在37°C下使用5％CO）在标准培养条件下进行。通过用10 mM-葡萄糖（U-13C6 ，剑桥同位素实验室CLM-1396-PK）代替葡萄糖，在用5μMAβ原纤维治疗或没有治疗之前
，进行脂质 。 　　如先前所述54，对原发性大鼠小胶质细胞进行了培养
。P10-20大鼠在冰冷的PBS上经常性灌注 ，并在灌注后立即将大脑迅速解剖
，并将其置于冰冷的PBS中。将脑材材料切碎，并将其转移到冰冷的均匀均匀剂（WHEATON）上 ，冰冷的PBS含有200μl每50 mL PBS的0.4％DNASEI 。组织块连续三回合
，分别为三到十个均匀的均质活塞，并离心
。在离心过程中添加了Percoll Plus ，以将髓磷脂与细胞分离。用PBS和10 mL的同量Percoll（9 mL Percoll Plus（GE Healthcare）
，10 mL的10×PBS，无CA和MG ，9μl
，9μL，1 M CaCl2 ，1 M Cacl2，5μL的1 mg cacl2
，5μl的1 mmgcl2），将细胞悬浮量调节至33.4 mL ，并添加了10×PBS的1 ml 10×PBS
，添加了5μL） 。离心悬浮液（15分钟，500g ，4°C）
，并丢弃髓磷脂的上清液和顶层
。根据制造商的说明，使用大鼠CD11b/c（小胶质细胞）Microbeads（Miltenyi ，CatalogNo。130-105-643）使用MACS列来富含大鼠小胶质细胞 。对无血清大鼠小胶质细胞基础小胶质细胞生长培养基进行无菌过滤
，并在4°C下储存长达1个月，由：含有100 u ml-1的DMEM/F12组成：100μgml-1的DMEM/F12 ，100μgml-1链霉菌素链霉菌素
，2 mm谷氨酰胺，2 mm谷氨酰胺 ，5μgml-n-cyn-n-n-cy cy cy cy cysine cysine cysine cysine cysine cysine cysine，胰岛素
，100μgml-1的替代蛋白和100 ng ml-1的亚硒酸钠，卵巢羊毛胆固醇（1.5μgml-1 ，Avanti Polar脂质）
，硫酸乙酰肝素硫酸盐（1μgML-1，1μgml-1最终培养基由含有人TGFβ2（2 ng ML-1 ，peprotech）
，小鼠IL-34（100 ng ml-1，R＆D系统）的基础培养基组成。将细胞铺在涂有聚赖氨酸（Gibco）的24孔板上
。细胞在37°C和10％CO2的加湿培养箱中生长。每2-3天进行一次50％的中等变化 。对于活细胞显微镜 ，将细胞未经处理或用5μMAβ原纤维处理 （如上所述）与Aβ抗体（细胞信号技术
，第15126号）预孵育与Alexa Fluor 555次级（Invitorogen），以及脂质Spot 488（Biotium ，70065-T）
，并摄入24小时
。所有动物护理和程序都符合《动物福利法》，并符合机构指南 ，并得到斯坦福大学实验室动物护理机构行政小组的批准。 　　遵守圆形盖玻片的细胞培养物位于次级号上 。1.5h盖玻璃（胸部），带有薄薄的PBS
。为了避免干扰脂质汽车信号的产生
，均未使用安装培养基，抗体剂和表面活性剂。盖玻璃的边缘用阀门密封 ，阀门是同等部分的石油果冻
，羊毛蛋白和石蜡的均匀混合物，可防止样品干燥 。 　　使用连贯的抗烟药拉曼散射（CARS）显微镜对IPS细胞衍生细胞中的细胞内脂质进行可视化和定量
。为此目的 ，使用了倒置显微镜（尼康
，配备了C2共聚焦扫描头和Nikon CFI Apochromat Tirf 100XC油浸入物镜）。将C2扫描仪用可滑动的镜子（Optique Peter）进行了改装，从而使使用激光二极管（在波长405、488 、561和647 nm）和CAR兴奋之间进行方便的荧光激发 。In CARS imaging mode, carbon–hydrogen (C–H) vibrations were coherently driven by temporally and spatially overlapping two near-infrared laser beams, generated by a picosecond-pulsed laser system (APE America, picoEmerald S with 2 ps pulse length, 80 MHz repetition rate and 10 cm−1 bandwidth) consisting of a 1,031 nm mode-lockedytterbium纤维激光器和光学参数振荡器（OPO）可调节700至960 nm（由1,031 nm激光的第二个谐波泵送）
。OPO波长设置为797 nm ，以在2,850 cm -1处驱动CH2的对称拉伸振动。汽车信号对探测的C – H振动组的数量密度的二次依赖性在不需要外部标签或破坏性样品制备的情况下对脂质密度区域形成了鲜明的对比度 。通过与光电倍增管（Hamamatsu
，r6357）在前方方向上检测到样品上的两个激发光束，通过光学过滤器（Semrock; Semrock;两个FF01-640-20-20-201-20-20-201-750 ff01-750/sp）在前方方向上检测到Pixel-Pixel产生的汽车信号。样品位置的激发能力为泵（OPO）束为18兆瓦 ，而STOKES（1,031 nm）梁的激发能力为15 mW
。对于类似IMG的细胞
，为每个APOE基因型和Aβ处理条件获得了5-16个图像堆。每个堆栈均以1,024×1,024像素的分辨率（77.14×77.14μm2）组成19片 。 每个像素的停留时间为10.8μs
。切片间隔为0.4μm，得出总成像深度为7.2μm。细胞特异性免疫组织化学促进了与共聚焦荧光的小胶质细胞（IBA1）的鉴定 ，该荧光与非线性成像相同的位置，其停留时间为每个像素为5.3μs 。小胶质细胞用Alexa Fluor 488染色
。对于选定的APOE/治疗组合
，通过改变785.5和801 nm之间的OPO波长，在C – H伸展区中获得了汽车光谱 ，以进行一个观点
，并以每次摄入为0.5 nm，每次摄取 ，总计32张图像堆栈的频谱。使用ImageJ的斐济分发套件分析了所有图像 。汽车堆叠进行了东阴影校正
，高斯模糊滤波（σ= 1）和背景减法（30像素滚球半径）
。使用Findfoci方法通过阈值鉴定脂质颗粒，其搜索参数为0.1 ，峰值为0.1
，相对于0的背景，最小峰高的峰值参数和200像素的最小峰值大小。通过使用三角形方法通过阈值鉴定细胞 。使用“ 3D对象计数器 ”命令对细胞内脂质特征进行量化
。为了生成光谱线图 ，将每个细胞中所有细胞内脂质特征的光谱进行标准化和平均。 　　如上所述
，用5μMA的APOE4/4 IMG用脂质Spot 488染色的5μMAβ原纤维进行处理，然后将FACS（Sonony ，MA900，MA900）的MGDM培养基（Sonony
，MA900）以每孔的5,000个细胞为96孔板，将最高10％和最低脂质激素荧光细胞播种到96孔板中 。收集了培养基上清液 ，并使用人类的48-Plex Luminex Procarta Immuno-say（Thermo Fisher）在斯坦福大学的人类免疫监测中心（Thermo Fisher）在培养上清液中测量了分泌的信号传导蛋白。 　　在300g和4°C下大约100,000 img
。接下来
，将颗粒轻轻地重悬于冰冷的50μl裂解缓冲液中（10 mM Tris-HCl pH 7.4
、10 mM NaCl，3 mM MGCL2、0.1％Igepal Ca-630） ，并在500G下向下旋转10分钟和4°C。将上清液丢弃
，并在50μL的转座反应混合物（25μl标记DNA缓冲液（Nextera，Illumina） ，2.5μl标记DNA酶（Nextera
，Illumina，Illumina） ，22.5μL免费水）和37分钟诱导37°C中
，将颗粒轻轻重悬于50μl的转置反应反应混合物中（25μL标记DNA缓冲液（Nextera，Illumina） ，2.5μl标记DNA酶（Nextera），22.5μl）和30分钟 。使用Minelute PCR纯化试剂盒（Qiagen）纯化标记的DNA
，并使用Ampurexp珠（Beckman Coulter）选择了70-500个碱基对（BP）的大小
。使用1.25μmNextera指数引物和Nebnext高保真2×PCR Master Mix（New England Biolabs）构建和放大库。运行定量PCR以确定最佳循环数 。在Illumina Novaseq 6000上选择了165–300 bp片段的凝胶尺寸，并在100个周期（PE100）中进行单端测序
。 　　带有默认参数的Bowtie2用于映射ATAC-SEQ。荷马被用来将对齐的读数转换为“标签目录
”以进行进一步分析55 。在复制中进行ATAC -SEQ实验 ，并使用参数-l 0 -C 0 -C 0 -FDR 0.9 -MINDIST 200 -Size 200
。使用不可重复可复制的发现率（IDR）来测试重复之间的可重复性。使用荷马合并将IDR峰合并
，并与本垒打AntotatePeaks.pl进行注释，尺寸参数为250 。使用FC> 1的DESEQ2鉴定了差分增强子峰（来自转录启动位点的±3千倍酶） ，并调整了P <0.05
。Homer Motif Analysis（FindMotifSgenome.pl）
，包括已知的默认基序和NOKO基序，用于识别在背景上富含增强子峰区域中富集的基序。背景序列来自随机GC匹配的基因组序列 。UCSC基因组浏览器用于可视化ATAC-SEQ数据。 　　对于Aβ处理的条件 ，在RNA分离之前
，将IMG暴露于5μMAβ原纤维或DMSO
。对于LD-HIGH与LD-LOW条件，IMG暴露于5μMAβ原纤维中24小时 ，如上所述
，用脂质Spot 488染色，最高10％和10％最低脂质点荧光细胞由FACS分离（Sony ，MA900）。使用Rneasy Plus微型试剂盒从细胞颗粒中分离出imicroglia RNA（Qiagen，74034） 。根据制造商的说明
，使用Smart-Seq V.4超低输入RNA试剂盒（Clontech）将mRNA转录为全长cDNA
。根据制造商的协议，使用Nextera XT DNA库制备试剂盒（Illumina）处理全长cDNA（150 pg）。使用Agilent 2100生物分析仪和Agilent高灵敏度DNA试剂盒验证了库质量 。使用Illumina Nexseq 550 ，配对末端
，2×100 bp深度序列进行测序
。使用Star（v.2.5.1b）将读数映射到人类HG38参考基因组。使用GeneCounts函数用Star生成原始读数计数 。使用R软件包DESEQ2分析RNA-Seq中的差异表达（参考文献48）
。 　　细胞在ACLAR上生长，然后固定在卡诺夫斯基的固定剂中：2％戊二醛（EMS目录号16000号）和4％多聚甲醛（EMS CatalogNo。15700）在0.1 m钠cacodylate（EMS Catalog No.12300）pH 7.4 calliendes for 1 H. 4 h和1 H上的cileford calloff in 0.1 m sodium cacododylate（EMS Catalog No.12300） ，并散布了coolford 。然后
，将它们在冷1％四氧化os（EMS CatalogNo
。19100）中的后缀中延误，并在水引擎盖中允许2小时加热2小时 ，用超过滤水洗涤3倍
，然后在室温下在1％的1％乙酸铀酰中染色2小时。然后将样品在室温下的一系列乙醇洗涤中脱水10分钟，从30％ ，50％
，70％，95％开始 ，变为100％2X，然后更改为氧化丙烷氧化10分钟 。将样品用嵌入-812树脂（EMS目录号14120）浸入1：1和2：1与丙烷氧化物2小时。然后将样品放入嵌入-812中
，进行2小时，然后将其放入带有标签和新鲜树脂的扁平模具中 ，然后放入65°C的烤箱中过夜
。将切片在90 nm左右取
，上面搭配FormVar/碳涂的Cu网格，在50％丙酮中染色40 s ，在3.5％乙酸铀酰中染色
，然后在Sato的铅中染色2分钟。在JEOL JEM-1400 120 kV中观察到这些，并使用Gatan Orius 2K×4K数码相机拍摄照片 。 　　U937细胞是从美国型培养物收藏（CRL-1593.2）中获取的
。使用旋转瓶在悬浮培养物中保持细胞 ，用于文库传播和组织培养板进行单基因敲除线
，全部用于无菌过滤的U937生长培养基（RPMI-1640（rpmi-1640），补充了2 mM谷氨酰胺 ，100 u ml-1 uml-1 uml-1
，100 mg ml-l-1均为100 mg ml-1的链霉菌素施用量为100％热疗法。孵化器设置为5％的二氧化碳 。在多种感染中，每一个基因组的十分组sgrna文库少于1次 ，在5 d上进行了尿霉素的选择（1μgml-1）
。对于LD屏幕，培养基中的10％FB被从几个捐赠者中汇集的10％年龄（超过80岁）的人血浆取代
，透析和删除以更好地代表老化的循环单核细胞环境，然后用Bodipy 493/503（1：2,000 fult）（1：2,000 furly）和10％的furl furl ferth fell。最低的Bodipy荧光细胞通过FACS分离（Sony ，MA900） 。 如所述
，通过两个顺序的PCR反应进行扩增并制备SGRNA序列，并制备进行测序
。使用Illumina NextSeq对产品进行测序以监视库组成（每个库读取30-40万次）。使用Bowtie将修剪的序列与库对齐 ，其中零不匹配
，并包含多模拟读数的所有比对 。使用Castle57 V.1.0分析了界限和未结合部分的指南组成和比较
。然后将单个sgrNA的富集计算为计数分数的中间归一化对数比，如所述57。对于每个基因 ，使用最大似然估计量来确定最可能的效应大小和相关的对数可能性比（置信度）
，通过将靶向基因靶向指南的分布与非靶向和安全靶向指南的背景进行比较 。 　　IMG CRISPR -CAS9筛选是使用CAS9蛋白电穿孔（切片）方法的改性SGRNA慢病毒感染进行的58。人类CRIS淘汰图书馆是M. Bassik（AddgeneNo
。101927）的礼物。简而言之，大约有4000万个APOE4/4 IPS细胞被慢病毒感染了十指定的Sgrna sublibraries ，其多种感染率小于一种 。被感染的细胞接受了紫霉素的选择（0.8μgml -1）2 d
，然后去除紫霉素，并将细胞重悬于没有嘌呤霉素的正常生长培养基中
。如上所述 ，将IPS细胞分化为IMG。在IMG - 人类星形胶质细胞共培养的第15天，IMG细胞被打沉淀并重悬于Lonza电穿孔缓冲液P3（Lonza
，V4XP-3032）中，每100 mL 500万个细胞 。将Cas9蛋白（Macrolab ，40毫米）添加到细胞悬浮液中
，以1:10 V/V比
。使用pulsecode DP-148（Lonza，VVPA-1002） ，将细胞以每100 ml每100 ml细胞为每100 ml细胞的500万细胞进行电穿孔。如上所述
，在将细胞转移到稳态培养条件下（MGDM培养基）之前，将细胞与人类星形胶质细胞共培养五天 。在重复的培养条件下 ，用5μMAβ原纤维处理细胞24小时
，用Bodipy 493/503染色（从DMSO中的1 mg ml -1的储备溶液中的1：2,000染色； Thermo Fisher； Thermo Fisher）和最高10％的最高和10％低的Bodipy荧光细胞由FACS（Sony，May ，May
，May，May ，May，May
，May900）分离
。使用Qiagen Blood Midi套件分别提取所有种群的GDNA， 使用常见的侧翼引物通过PCR扩增SGRNA序列 ，并在第二个PCR中附着在扩增子上。使用Illumina NextSeq550上SGRNA序列的深度测序用于监测库组成 。分析了指南组成并将其与质粒文库以及使用Castle57之间的条件进行比较
。计算单个指南的富集是根据LD-HIGH和LD-LOW种群之间的对数比
，基因级效应是根据针对每个基因的十个指南计算的。然后，如前所述57 ，通过置换靶向指南来计算P值 。 　　如先前所述的16
，人类诱导的多能干（臀部）细胞被衍生在神经元中，并进行了轻微的修饰以增加产量。将臀部细胞与ACCUTASE分离 ，然后用温暖（37°C）N2B27培养基淬灭
。N2B27培养基由1：1 DMEM/F12（11330032
，Thermo Fisher）和Neurobasal Media（21103049，Thermo Fisher） ，1％N2补充（21103049
，Thermo Fisher），1％B27（1％B27）（1％B27）（17504044 ，17504044，Thermo Fisher）
，1％MEMINE fisher Amino AINDICERIDERICID（1％）（1114），1％000 ，1％
，1％，1％ ，1％；谷氨酸（35050061
，Thermo Fisher）和0.5％青霉素 - 链霉素（15140122，Thermo Fisher）。然后将解离的臀部细胞固定并悬浮在胚胎体培养基中（10 µm SB431542（1614 ，Tocris）和0.25 µm LDN（04-0074
，N2B27）中，具有10 µm岩石抑制剂（1254 ，TOCRIS）
，持续的速度为10 µm，持续的速度为10 µm 。费舍尔科学）
。在前3小时内 ，每小时手动摇动烧瓶。在第2 、4和6天，将培养基替换为没有岩石抑制剂的新鲜胚胎体培养基 。在第8天
，将球体作为神经祖细胞铺在10 cm的盘子上，该菜肴含有生长因子降低（GFR）Matrigel（CB-40230A ，Fisher Scientific）
。允许神经祖细胞形成神经元的玫瑰花结
，并仅在N2B27培养基中维持8-15天。在此期间，根据汇合和媒体的消费 ，每48-72 h更换了一半的媒体 。在第16天
，使用Stemdiff神经玫瑰花结的选择试剂（05832，Stemcell Tech）提起神经元的玫瑰花结 ，并将其镀在N2B27中的六孔板的三个孔中
，并用100 ng ml-1 ng ml-1 fgfb（100-18b，peprotech ，peprotech）和100 ng ml-1 egf（affgfb）和100 ng ml-1 egf（affgfb）（100 ng ml-1）每天更换具有FGFB和EGF的N2B27培养基
。在第20天
，通过与ACCUTASE解离，用N2B27淬火并在STEMDIFF神经祖细胞培养基中重悬（05833 ，Stemcell Tech），将神经祖细胞转移
，用N2B27淬灭。 六孔板的一个孔每2 mL 1.2×106个细胞，含有GFR Matrigel 。在第21-27天 ，每天将神经祖细胞用新鲜的神经祖细胞培养
。在第28天
，将神经祖细胞与ACCUTASE分离，添加N2B27培养基以使细胞悬浮液的体积使40 mL ，并通过40 µM细胞过滤器（08-771-1
，Fisher）过滤细胞。然后通过离心收集细胞，并重悬于完整的神经元培养基中 。神经元培养基由10 n2b27中的10 ng ml-1（450-02 ，peprotech）和10 ng的GDNF（450-10
，peprotech）组成，具有10 nm dapt（2634 ，tocris）。接下来
，将细胞计数并以每孔2×105个细胞的浓度计算到24孔板中的12 mm涂层玻璃盖（354087，康宁）上
。覆盖物在电镀之前用聚赖氨酸（P4707 ，Sigma-Aldrich）和小鼠 - 层蛋白（23017015，Gibco）涂覆。然后
，每3-4天在成熟的神经元上替换50％的培养基 。第一周后，DAPT被删除
。对已经分化了4周的神经元培养物进行了实验。 　　通过将IMG暴露于5μMFAβ的100万APOE4/4 ，APOE3/3和APOE-KO IMG的LDAM-HIGH和LDAM-LOW条件培养基24小时通过将IMG暴露于5μMFAβ中
，用PBS洗涤3倍，用PBS染色 ，用脂质Spot 488染色
，如上所述，如上所述 ，如上所述
，由FOOS 10％最高和10％的lipidsspots andony andony andony andony andony andony（Sornone）（Serone）的含量为facots and Nays andony（Sornone）（Serone），并分类了（Sornone）（Serone）（Serone）的Ma Ma Ma May（Sornony）（Sornony）（Sornose） 。N2B27培养基（如上所述）补充了IL-34的100 ng ml-1 ，CSF1的10 ng ml-1和TGFβ的10 ng ml-1持续12 h
。通过以2,000克离心培养基上清液10分钟来收集条件培养基以去除细胞碎片。在处理神经元之前
，将IMG条件介质的10％添加到新鲜的N2B27中，用10 ng ml-1的BDNF（450-02 ，peprotech）（450-02，peprotech）和10 ng ml-1的GDNF（450-10
，peprotech） 。为了用各种LDAM培养基处理神经元，将N2B27神经元培养基完全从细胞中删除 ，并用含有GDNF和BDNF的IMG条件培养基代替
。48小时后
，固定神经元进行免疫细胞化学。 　　将神经元用1×DPB（14080055，Gibco）洗涤 ，并固定在4％多聚甲醛中15分钟 。然后将神经元用含0.1％Tween的1×DPB（14080055
，Gibco）洗涤3次，持续5分钟
。接下来 ，将神经元透化并用1小时的1 h洗涤在1×DPB（14080055
，Gibco）中，其中含有10％正常驴血清（017000121 ，Jackson Immuno）和0.5％Triton-X。然后将细胞用原代抗体在靶向以下蛋白质的4°C下过夜染色：MAP2（PA1-10005
，Thermo Fisher Scientific，1：5,000） ，AT8（MN1020，Thermo Fisher Scientific
，1：500）和caspase-3（9661，细胞信号技术 ，1：500） 。将第二抗体IgG与Alexa Fluor 488（驴抗小鼠
，A-21202，Life Technologies Corporation ，1：1,000）
，1：1,000），Alexa Fluor 594（Donkey Antikibbit ，A-21207
，A-21207，Life Technologies Corporation ，1：1,000）和Alexa Fluor 647（Donkey Anti-nikey 5-15-15-15-15-15-15-15-15-15-15-15-15-15-15-15-15-15
，703，703 ，703，703
，免疫，1：500）。用vectashield用DAPI（H-1200-10 ，Vector Labs）将盖玻片安装到显微镜载玻片上
。用×20或×40的FV3000共聚焦激光扫描显微镜（Olympus）拍摄图像。使用在开源斐济（ImageJ）软件中编写的自定义宏进行的髋部细胞衍生神经元染色中的AT8或CASPASE-3阳性进行图像分析 。对于所有图像分析
，在测量前选择了标准阈值并自动应用于每个图像的每个通道
。为了定量AT8免疫荧光，将AT8免疫荧光的总面积标准化为MAP2免疫荧光的总面积。为了定量caspase-3免疫荧光 ，将caspase-3阳性的总数标准化为DAPI阳性的总数 。 　　出生后的第一天
，新生小鼠幼崽通过斩首人道杀死，并使用显微解剖技术小心地收集了皮质
。然后用解剖培养基（Thermo Fisher Scientific ，14170161）冲洗新鲜获得的皮质
，然后使用剪刀进行组织解离，0.25％胰蛋白酶和移液管Trituration。孔径为70 µm的细胞滤网用于去除消化皮质的任何剩余的组织碎片 。然后将解离的神经元铺在24孔板上 ，用覆盖的覆盖层覆盖的覆盖层（新人供应
，1339 a），使用最低必需培养基（Thermo Fisher Scientific ，21010046）补充了10％灭活的胎儿小腿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Fisher Scientific
，10438026），2 mm glutine（2 mm Glutine）（Thermo Fisher Scientife科学 ，SV30010）
。初始播种24小时后
，使用Neurobasal培养基（Thermo Fisher Scientific，21103049）进行了完整的培养基变化 ，并补充了B27（Invitrogen
，17504044）和2 mM Glutamax（Thermo Fisher Scientific，35050061）。将原发性神经元细胞保持在37°C的温度下 ，并具有5​​％的二氧化碳环境 。参考文献中描述了详细的协议
。59。 　　由50μlACN：IPA：水比为13：6：1（v/v/v）的缓冲液重组干燥的脂质 。然后
，使用涡旋在4°C剧烈混合了10分钟。之后，将样品在4°C下以最大速度离心10分钟
。然后将45μl上清液的体积小心地转移到玻璃插入小瓶中 ，以使用液相色谱 - 质谱法进行进一步分析。 　　使用配备加热电喷雾电离探针的ID-X三元质谱仪进行脂质分析 。使用ASCentis Express C18柱与护罩柱结合使用的Ascentis Express C18柱进行基于C18的脂质分离
。移动相由甲酸铵和甲酸溶于水
，乙腈和2-丙醇组成。优化了质谱仪参数，包括温度 ，分辨率，电压和气体设置
，用于脂质分析 。HCD碎片和数据依赖性串联质谱法用于全面脂质鉴定
。LipidSearch和复合发现器软件用于无偏差分析和脂质注释。使用TraceFinder（Thermo Fisher Scientific）准确地定量了代谢物丰度 。将5 ppm的质量耐受性用于提取离子色谱图，以确保准确测量脂质浓度
。该方法的完整细节可在参考文献中找到。60 。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得
。
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