如我们先前的研究7所述进行跟踪显微镜 。动作取消是通过自定义的三轴电动系统进行的，在其他地方进行描述（Mohan等 ，手稿中的手稿） 。为了启用动物跟踪 ，行为室被四个定制的灯条照亮，由窄角 ，850 nm红外发光二极管（LED;no。SFH4655-Z ，OSRAM，OSRAM）通过总内部反射将红外光线输送到室内 。行为室中的环境白光照明由一系列广角白色LED（no 。GWPSLM31.FM）提供。
为了记录神经活动 ，我们使用DIFF显微镜对细胞分辨率下的1,013×764×150 µm3的大脑面积成像 ，如先前的研究7所述，在细胞分辨率下，体积速率为2 Hz ，帧速率为200 Hz 。在我们以前的研究中 ，成像系统的性能和特征已经深入了特征7 。
根据实验的复杂性，使用了腔室壁的几种构造。所有行为室的顶部和底部均由玻璃制成 ，可从上方和低于7。如前所述 ，在玻璃板之间，1毫米厚 ，可渗透的PDMS壁（Sylgard 184 ，Dow Corning）来形成一个水密刚体的体系7 。使用计算机控制的刀片切割PDMS室，并通过手动切割完成 。在鱼装载之前 ，腔室里充满了E3水（“鱼装 ，去除和重新加载 ”）。鱼装载后，我们通过在顶盖玻片上滑动轻轻关闭腔室 。除去多余的流体以在PDM和两个玻璃表面之间形成水密密封 。每个成像会持续45-100分钟 ，以确保竞技场的足够空间覆盖（每个实验将在下面更详细地描述）。在实验期间 ，我们没有在分析中持续超过20分钟的分析中包含任何鱼类 。如果未明确指定，所有房间最初都是鱼类的新手 。
对于全室旋转实验（图4M）和矩形到圆形实验（图6A），外壁（1毫米厚）是由透明的白色PDM制成的 ，切成所需的腔室形状。地标是由嵌入外墙嵌入的黑色PDMS构造的 。透明的PDMS内壁（0.5毫米厚 ，宽1.5毫米）放在外壁旁边，可防止鱼与外壁或地标直接相互作用 。为了进行腔室旋转实验 ，首先在矩形腔室（S1）将动物成像90分钟 ，然后将整个腔室慢慢旋转10–20 s，不移除动物（即腔室壁 ，天花板 ，地板和鱼都旋转在一起）。然后将动物成像再成像60分钟（S2） 。
对于需要旋转室壁的实验，而无需去除腔室的动物或拆卸的实验（图5M） ，仅使用了中央正方形切口为60×60 mm2的外部PDMS壁 ，仅用于将腔室密封 。内室壁（来自外部PDMS壁的不同尺寸和形状）是由带有嵌入式不锈钢碎片（430级）的激光蚀刻塑料（430级）构建的，可以使用小磁铁（直径为3-5 mm）远程重新定位塑料室墙。地标（使用时）被涂在塑料室的壁上。将塑料室墙放在外部PDMS壁的方形切口内 。动物运动仅限于塑料室内的墙壁 。鉴于该腔室设计的灵活性 ，我们还将其用于图5a ，e，i和扩展数据图9a所示的实验。
在壁挂实验中，我们首先记录了动物45-90分钟（S1） ，然后从显微镜中取出整个腔室组件 。然后 ，使用腔室底部玻璃底部的小磁铁，然后在更换显微镜上的腔室组件之前小心地将腔室壁旋转180° 。在此操作中 ，墙壁仅旋转 ，但没有旋转。壁旋转后，将动物记录为另外45-75分钟（S2） 。
对于壁挂实验（图4i） ，我们构建了一个变形室 ，该室由八块不锈钢（12×2×1 mm3）组成，由柔性的有机硅（1 mm宽和0.5 mm）连接 。不锈钢块可以使用腔室底部玻璃底部下方的小磁铁（如上所述）远程重新定位 ，从而使室壁的柔性和逐渐变形。如上所述 ，仅使用60×60 mm2的中央正方形切口的外部PDMS壁仅用于供水，并将变形室放置在方形切口内 。动物运动仅限于变形室内 。我们首先将变形腔室排列在一个径向的近对称八角形中 ，并记录动物45-65分钟（S1）。然后 ，使用腔室底部玻璃底部的小磁铁，然后将腔室墙变成椭圆形 。在此操作期间，我们确保墙壁与鱼的身体接触没有强烈的物理接触 。变形后 ，将动物记录为45-70分钟（S2）。
对于边界插入和 - 拆卸实验（扩展数据图3B） ，我们使用了一个PDMS室，该室具有84×15 mm2中央切口 ，其中动物可以自由移动。在腔室的长轴的中点 ，我们创建了一个隐藏的矩形袋（21.5×2 mm2），其中包含一个不锈钢矩形杆（20×1.5×0.5 mm3） 。使用小磁铁 ，不锈钢杆可以插入腔室（创建额外的边框墙壁）或隐藏在腔室中 。在S1（45–95分钟）中 ，可移动的壁隐藏在动物中。在S1之后，将可移动壁插入腔室内的内部 ，并记录动物45-95分钟（S2） 。S2之后 ，再次将动物壁缩回并隐藏在动物中，并再次记录了45-90分钟（S3） 。
对于具有里程碑意义的驱动实验（图4E） ，我们使用了带有25×25 mm2中央切口的PDMS室。在腔室的一个边缘 ，我们创建了两个额外的PDMS口袋（100×2.5 mm2），每个PDMS口袋都包含一个70×2×0.5 mm3白色（丙烯酸涂料），不锈钢 ，矩形条 。地标（垂直黑色条纹）涂在其中一个不锈钢杆（图4E）的一部分上 ，而对立的不锈钢棒完全是白色的 。在S1（75–90分钟）中，位置位置位置 ，以使鱼可见。在S1之后 ，通过将小磁铁涂在腔室的底部玻璃杯上，带有地标的不锈钢件被远程移动到PDMS袋中 ，有效地将地标隐藏在腔室内的动物中；对立的不锈钢杆没有被移动 。然后再次记录该动物60-100分钟（S2） 。
对于所有实验 ，使用玻璃或塑料移液器将鱼装入腔室中。对于S1和S2之间去除鱼的实验（图5A，E ，I和6A） ，我们使用了以下步骤 。在前60–90分钟记录（S1）之后，将腔室从显微镜中取出 。腔室的顶部盖玻片松开 ，然后部分或完全去除。然后用玻璃或塑料移液器将鱼从腔室中取出。在两次会议之间 ，将腔室用肥皂和异丙醇彻底清洁，然后压力2-5分钟 。对于两条鱼（扩展数据图8G），我们在不清洁的情况下旋转了底部玻璃 ，以扰乱任何潜在的嗅觉提示 。我们将鱼重新加载到与动物被移除的标题和位置不同的标题和位置。鱼载后 ，再次将腔室与顶部玻璃盖玻片密封，并转移到显微镜上进行第二次成像疗程（45-100分钟） 。对于ABA实验（扩展数据图9A） ，采用相同的程序将鱼加载到B室中以进行S2 ，然后将鱼加载到A室中的S3中 。
为了研究PFS如何受环境的亮度影响，我们设计了一种光/深色协议。在录制鱼探索圆形PDMS室的60分钟后 ，我们关闭了白色LED ，向房间提供了可见的照明 。关闭白色LED导致在腔室中心测量的亮度从7.05变为0.01 µW mm -2 。为了确保向灯光关闭的过渡不会产生厌恶反应，亮度在1分钟内逐渐改变。然后将记录恢复60分钟 。
我们注意到 ，由于其对神经成像的要求 ，在所有条件下，半径为0.5 mm的小蓝色聚光灯总是以鱼的大脑为中心 。我们测量了从该聚光灯的光散射为0.14 µW mm -2在源源5 mm之内。
使用基于光电二极管的光电传感器具有已知检测器区域（No 。S130C ，Thorlabs）进行光强度测量 。
从跟踪显微镜中的每个荧光图像都注册为从同一动物收集的高分辨率参考脑体积。我们以前的研究发表了对注册管道的深入描述和表征7。简而言之 ，通过优化三维刚性变换来获得初始的粗略注册，该刚性变换将移动图像映射到参考脑体积内（可能倾斜的）平面 。然后将该平面表面细分为可变形的表面，该表面使用正则化的分段仿射变换在参考量内进行了局部调节 。
我们使用计算形态计量学工具包（CMTK）51将每只动物注册为常见参考鱼类。选择Atlas Fish52作为常见参考大脑 。每个大脑都以一系列步骤注册到参考大脑中：初始化 ，刚性 ，充分仿射，经线 。然后保存每个单个单元的坐标转换。命令行命令如下：
cmtk make_initial_affine-中心的smass move_image fixed_image intire.list 。
CMTK注册 - 初始初始 。名单 - nmi- -dofs 6 - dofs 12 -nmi -nmi - 探索8 - accuracy 0.8 -o affine.list mover_image fixed_image field_image
CMTK WARP - -NMI-NMI-Threads 160 - jacobian-jight 0 - -fast -e 18- grid-stacing 100- Emergy-weight-weight 1e-1- refine 4- refine 4- coarsest 10-ic-weight 0-utput-uptup-uptup-interteriatientiation -Accurcuracy accuracy accuracy accuracy accuracy 0.5 -o warp.list warp.list arterist.list.list.list.list.list.list.list.list.list.list.list.list.list.list.list.list.list.list.list
cmtk重新印-PAD -OUT 0 -O OUT_IMAGE-浮动fixed_image mover_image warp.list。
cmtk streamxform warp.list cell_coordinates_registered.txt
正如我们先前的研究27所述 ，非阴性基质分解（NMF）将每个细胞分为两个组成部分 - 空间足迹和一个随时间变化的活性成分 。简而言之 ，在注册后，我们将约束的NMF32应用于具有核局部荧光的全脑数据集 。对给定脑体积的每个轴向段进行NMF。我们的参考体积的轴向切片分离为2 µm ，斑马鱼细胞的平均直径约为5 µm 。因此 ，如果细胞跨越一个以上的轴向平面，则可以双重计数质心 。在整个参考大脑体积中检测到细胞中心质 ，但仅在整个成像过程中至少在30％的时间点中采样时 ，才被包括在下游分析中。我们基于近距离接近度（水平距离1.4 µm或更少，垂直距离为2 µm或更少）和高度相关的活性（超过0.7） ，将这些属于同一细胞的细胞质心合并为同一细胞。合并后 ，细胞数量为73,621±10,558（平均值±S.D 。），跨动物（n = 6 Fish）降低了28.4±2.6％（平均值±S.D.） 。
在30分钟的滑动窗口内使用第十个百分位数估算每个合并单元的荧光基线。然后，通过从原始荧光痕迹中减去估计的基线来获得基线校正的荧光痕迹ΔF（t） 。
要识别PC ，我们首先为每个神经元生成一个空间活动图（见下文） ，使用此图来计算空间信息和特异性8（见下文），通过循环置换生成洗牌数据 ，以获得空间特异性的无效分布（请参阅下文） ，最后，将每个单元格与无效分布的分布和分布的分布进行比较（请参阅下面的分布） ，并在下面的分布中进行分配（并在下面分布） 。PC识别的空间信息/特异性标准最初由Skaggs等人定义。8 。我们使用的标准与哺乳动物和鸟类的现有文献中的标准相似 ，用于电生理和钙成像数据16,53 。
为每个神经元生成一个空间活性图，代表每个空间位置的平均神经活动。为了计算空间活动图 ，将腔室分为平方箱（侧面长1.2 mm） ，然后计算每个箱的求和神经活动和占用时间 。这导致了两个矩阵：一个求和的神经活动矩阵和一个占用矩阵（矩阵条目对应于空间箱） 。然后，我们将受边界约束的高斯滤波器（标准偏差一个箱 ，由腔室边界定义的边界）应用于这两个矩阵。空间活性图是通过将被过滤的求和神经活动矩阵除以过滤的占用矩阵以获得每个空间箱中过滤的平均活性来计算的 。当鱼是固定的（低于0.1 mm s -1的速度）时 ，相应的帧未包括在空间活动图的计算中 。对于所有实验空间活性图（例如，对于跨会话的空间图比较），我们将最初暴露于S1中环境的前15分钟排除了。对于会节内的控制（S1的第一半和第二半之间的比较） ，我们在S1的第一半和第二半分别生成了空间活动图。在会议内控制中未排除前15分钟 ，以确保鱼类轨迹对环境的足够覆盖 。
从每个单元的空间活动图中，可以使用空间信息来量化该单元对动物位置所包含的信息 ，每秒以每秒8的位数为单位 。对于每个单元 ，空间信息我被计算为
其中x是空间bin，p（x）是鱼在空间bin x ，λ（x）中的概率是当鱼在空间bin x和λ中时 ，细胞的平均活性是平均神经活性，计算为。
基于上述方程 ，具有较高平均神经活动的细胞倾向于具有较高的空间信息 。为此 ，我们将特异性s计算为
换句话说，特异性是空间信息除以平均神经活动 ，导致每个活动单元的位单位 。
由于我们的基线校正 ，垃圾箱偶尔会有负平均活动。该垃圾箱以及高斯过滤后总占用时间小于1 s的垃圾箱不包括在空间信息和特异性的计算中 。
为了测试每个单元的特异性的重要性，我们使用圆形排列来构建无效分布 。对于每个单元，我们将有效的时间点定义为记录神经活动的帧 ，鱼运动速度高于0.1 mm s -1。然后 ，特异性的无效分布将通过测量在有效时间点内的神经活动载体在有效时间点内的特异性测量来估计（每个偏移量为0.5 s，因此覆盖为-250至+250 s） 。给定单元的特异性通过减去零分布的平均特异性并除以零分布的标准偏差 ，将其转换为特异性z评分 。为了测试细胞在人群水平上特异性的显着性 ，还通过减去所有记录的细胞的平均特异性并除以所有记录细胞的特异性的标准偏差来计算种群特异性z评分。
要归类为一个位置编码的单元，需要一个细胞具有大于或等于5的特异性z得分 ，人口特异性z得分z得分大于或等于3 ，并且特异性值超过每个活动单位0.01位 。
每个神经元的位置场（PF或发射场）被定义为空间活性的80％（峰值定义为95％）的空间箱集，该空间活动图的80％ 。在扩展数据中描述了单峰和多模式PFS的更深入和系统的分析图1i – k ，其中活性阈值从50％扫描至80％。PF的位置由单个PF的单元格代表。对于具有多个PFS的细胞（作为地图中的不同组件） ，我们使用组件的COM（超过20个箱子，以避免由于噪声引起的虚假PF） ，最高峰活动（定义为组件的第95个百分位数）作为其主要PF的位置 。PF的分布和PF偏移分析中 ，只有PF大小的PC小于30％的PC 。PF仅用于分析PF跨环境中PF位置的可视化。PC活性的所有其他分析，例如PF相关性，PV相关性 ，特异性和位置解码的变化 ，都可以直接使用空间活动图 。
实验是用各种腔室进行的，有时会以不同的方向进行 ，有时在将腔室变成不同形状之前和之后 。为了比较这些室内的空间活动图 ，我们开发了在会话中注册图的方法。如果室壁几何形状没有变化（例如，全室旋转） ，则通过S2活性图的旋转和翻译（即刚性转换）进行注册 ，以便以S1的空间垃圾箱表示，从而代表了S1的活动 ，从而促进了比较（'PV Correlation ，Pf Correlation，Pf Correlation ，Pf Correlation ，Pf Correlation，pf Correlation，Pf Correlation and Pf Correlation and Pf Correlation and Pf Correlation and Pf Correlation and Pf Correlation and Pf Correlation and Pf CorreLation and Pf Correlation'） 。
否则 ，我们进行了非刚性转换 ，以在会话之间登记空间活动图 。我们的策略首先是在两个会话的腔室壁之间建立对应关系，然后根据其与壁锚点的距离 ，将S2的每个空间箱映射到S1中的一组空间箱 ，最后以S1的空间箱表示S2的活性。这些步骤中的每一个都在下面更详细地描述 。
首先，我们在两个会话中都检测到了腔室的墙壁 ，并在腔室墙壁上定义了一组锚点 。由于会话之间检测到的墙点的精确数量可能会有所不同 ，因此我们使用线性插值以更少的点为会话的墙点进行样本，以使锚点的数量在会话之间相同。基于地标（例如 ，壁清去的壁挂式实验；图5i）或显微镜参考框内壁的极性在几何形状或地标之间没有明确匹配的情况下 ，建立了跨会话之间的锚点之间的对应关系 。S2中的锚点相对于S1（扩展数据图8C，D和10；“具有最佳旋转角度的非刚性转换 ”） 。
接下来 ，对于S2中的每个空间箱中心（X ，Y），我们使用COM过程在S1中计算相应的位置。具体而言，对于S2中的每个锚点 ，我们将重量关联 ，其中d是锚点与S2中的空间箱中心（x，y）之间的距离。然后 ，我们使用两个会话之间的先前确定的墙对应关系将这些权重传递到S1中的锚点 。然后将S1中的相应位置定义为S1锚点的COM（即S1锚点的加权总和除以权重总和） 。
最后 ，我们代表S2的活性，而S1的空间箱。S1中计算的位置通常位于S1活性图的空间箱中心之间 ，因此我们识别带有bin中心（x ，y）的4×4空间箱 。通过这种方式，我们将每个S2空间箱与S1中的4×4空间箱相关联 。此过程确保每个S1空间箱至少与一个S2 bin相关。然后 ，我们平均与S1中给定空间箱相关的所有S2箱的活性平均产生了S2活性以S1的空间箱表示 。
通常 ，假设会话之间的旋转角度为0°（例如，图4i ，5i和6a） ，通常应用上述S2地图的非刚性转化 。为了系统地研究是否在会话之间发生相干图旋转（扩展数据图8D），将72个增量旋转（覆盖360°）应用于S2锚点，然后按上述非刚性注册。最佳的旋转角是通过跨会话之间的最大PF相关性（“ PV相关性 ，PF相关性和PF移位”）来识别的 。我们将此过程称为“具有最佳旋转角度的非刚性转换 ” 。请注意 ，这也是针对扩展数据中的早期控制的图8C，e。
为了测试PF相关性的改善 ，从“非刚性登记 ”的角度为0°”到“具有最佳旋转角度的非刚性转化 ”是否显着 ，我们将S2中的细胞身份洗牌 。随后，我们将PF相关性的改善从非刚性登记进行比较 ，假设具有最佳旋转角度的非刚性转换的角度为0° ，则具有0°的角度 。重复1000次以产生无效分布。扩展数据中的p值是通过计算造成的百分比来计算的，在这些混音的百分比中 ，实际数据的改进小于洗牌控制。
为了比较各个会话的人口级活动 ，为每个会话共享的每个空间箱计算了人口矢量相关性（即PV相关性） 。对于每个神经元，我们首先为每个会话计算ΔF/F空间活性图 。为此 ，我们通过将荧光信号低于20％的空间箱的平均值来估算每个地图的基线荧光信号。然后 ，计算每个空间箱的ΔF/F如下：
其中a是空间箱的平均荧光信号 。当基线低于10时，添加了伪C 。对于每个空间箱，我们获得了两个人口活动的两个向量（每个会话一个）。向量的长度等于从任何一个会话中识别的端脑PC的总数 。两个活性向量之间的相关性产生给定空间箱的PV相关性 。
为了确定空间活动图的相似性 ，我们计算了空间活动图（即PF相关或空间相关）之间的相关性。对在图中共享的空间箱进行相关性 ，并通过每个地图的均值和方差进行标准化 。在任一程中，使用了所有识别为PC的端脑细胞 。
为了衡量PF跨会话的范围 ，对于每个神经元 ，我们在每个会话中都确定了其PF的COM。我们将PF移动定义为S1和S2中单元格PF的COM之间的距离 。在这两个会话中，只有具有密闭PF的细胞（射击场大小小于腔室大小的30％；“定义位置场 ”部分）进行此分析 。
对于会议内的控制 ，我们生成了两个单独的空间活动图 ，与S1的早期和晚期相对应。PV相关性，PF相关性和PF移位是使用上述过程从会议内控制空间活动图计算出来的。为了与对照进行比较 ，我们确保使用相同的神经元（用于PV相关 ，PF相关和PF移位）和空间箱（用于PV相关和PF相关） 。单侧Wilcoxon签名的秩检验用于测量PF相关性和PV相关性是否明显低于对照，以及PF移位是否明显高于对照 。
模糊是在径向向外方向的给定点处的PF拓宽。为了估计由于鱼的速度 ，PFS的这种模糊效应 ，结合钙指示器动力学，我们计算了上限和下限 。通过假设10 Hz发射速率和平均负标准偏差的速度来计算下限；上边界的发射速率为100 Hz，平均速度加上标准偏差 。速度分布由七个鱼类的合并速度数据组成（扩展数据图1F）。参考文献从参考资料中获取半末期的半纪念日数据 。54 。将时间荧光衰减的半个时间乘以速度值 ，以获得空间荧光衰减的半距离（扩展数据图1G）。在该指数空间衰减中 ，衰减所需的距离降低到开始值的80％（扩展数据图1H）；这与我们对PF的定义相匹配，并用作模糊的估计值 。基于行为数据（扩展数据图1F）和钙指示剂动力学 ，这两者都取决于点火速率54 ，我们估计PFS的半径在空间上模糊0.17-1.31 mm 。
使用scikit-learn55进行“ n_neighbors = 100”进行ISOMAP37嵌入。构建了代表所有端粒PC的种群活性的矩形矩阵，构建了30分钟的跨度 ，适合数据的ISOMAP歧管（在一个时间点的歧管中 ，每个点都代表了一个时间点的歧管），最后在图3a中提取了二维嵌入以进行可视化和计算 。由于实现不处理丢失的数据 ，因此我们在具有最接近前面的可用值的单个单元格的活动跟踪中填写了丢失的值 。在实验开始时缺少值的情况下 ，将应用向后填充。对于图3A，B分别拟合了人口活动数据的早期（0-30分钟）和晚期（60–90分钟）的窗户 ，因此具有不同的二维嵌入。对于补充视频2 ，我们将ISOMAP歧管拟合到成像S1的最后30分钟（室内旋转之前；图4M），以建立稳定的轴以进行二维嵌入，然后重复将30分钟的人口活动数据的每个窗口转换为此嵌入 。应用了基于运动的标准排除标准（“识别PC”中的空间活动图） 。
为了量化二维流形和鱼的物理位置之间的关系 ，我们使用邻居距离 ，这量化了歧管空间中当地邻居的程度，也是腔室物理空间中的本地邻居。在给定的30分钟时间窗口中 ，我们通过在歧管空间中选择其30个最近的邻居 ，然后测量30点和种子点之间的腔室中物理距离，以获取种子点的平均物理邻居距离 ，从而分析了二维歧管空间（“种子点 ”）中的每个时间点 。然后 ，我们通过在歧管中的所有时间点上平均计算总体物理邻居距离 。作为基线，对于每个种子点 ，选择了歧管中的30个随机邻居 ，然后像以前一样计算物理邻居距离。
为了分析两个会话之间或会话的早期间隔和晚期间隔之间的分析（图3），每个空间箱的占用率通过亚采样均等 。也就是说 ，对于每个空间箱 ，我们确定了具有较小时间点的会话或时间间隔，并从会话或时间窗口随机窗口中随机采样带有更多的时间点，以便两个时间窗口在每个空间箱中具有相同的时间点 。
直接基础解码器36是一个线性解码器 ，没有自由参数 ，可以通过空间活动图的线性组合来预测动物在每个单个时间点的位置，并与相应的位置编码单元的活性加权。所有解码和地图构造仅在鱼移动的那个时间点进行（鱼速度大于0.1 mm s -1） 。即使不需要学习参数 ，仍然有必要计算每个单元的空间活动图 。为了避免在计算空间活动图和测试解码器之间进行循环 ，我们使用了交叉验证方案，其中神经数据被分为非重叠的1分钟块。为了测试每个1分钟块上的解码器 ，我们首先计算了空间活动图 ，而无需包括测试块或其两个相邻的块 。将所有1分钟的预测串联为整个数据集的预测 。然后将解码器误差计算为在数据集中鱼的预测位置和实际位置之间的平均距离。
如上所述，使用空间箱（侧长1.2 mm）和边界约束的高斯平滑构建空间活性图。除了扩展数据中显示的分析图5C中 ，该地图构造中使用的活性相对于鱼的位置而变化2 s ，以抵消潜在的钙滞后动力学 。所有地图均通过平均值和标准偏差标准化 。为了制备解码器，将7.5 S的盒装平均过滤器应用于活性 ，然后通过其各自的活性加权了最活跃的30％的细胞的地图 ，并总结以形成解码器图。这个非线性阈值步骤旨在省略低强度信号，从而为解码造成噪声 。然后将解码器图归一化，以取决于表示的密度差异 。为此 ，我们计算了所有空间箱上的表示直方图 ，该直方箱为每个空间箱定义为其主要PF（定义位置字段）中包含该垃圾箱的PC数量。因为我们发现表示密度对解码误差的影响是sublerear的，所以我们通过表示直方图的第三根词根将解码器映射归一化 。然后 ，通过解码器映射的第99个百分位数的COM计算每个时间点的位置估计值 。如果未指定不同的话 ，则将每只动物最高空间调谐的1,000个脑脑细胞用于所有解码分析。为了选择顶部空间调谐的细胞，我们根据其特异性z得分以及其种群特异性z得分对每个端脑置换位置编码单元进行排名 ，然后根据两个等级中的较差分配其最终等级（图2F） 。这允许在可能有不同数量的PC的鱼之间进行公平的比较（图1G） 。为了选择良好解码所需的最小单元格 ，使用了一种迭代，贪婪的算法（图2G）。从零神经元开始 ， 我们发现要添加到解码集中的单个最佳神经元 ，以最大程度地减少所得解码器误差，然后迭代地重复相同的贪婪选择过程 ，以增加解码集 ，一次是一个神经元 。
为了分析大脑区域的解码器误差（图2E），为每个定义的区域（全脑，端脑 ，MES ，MES和Rhombencephalon）选择了1,000个顶级调谐细胞 。随机细胞群是从群体z评分小于1的细胞中随机选择的，以明确包含无PC。我们定义了两个基础来评估解码器性能。对于均匀的随机基线 ，我们测量了解码器的平均解码器误差 ，该解码器输出从腔室均匀采样的随机位置 。该过程重复1000次，平均解码器误差将其视为均匀的随机基线 。对于行为信息的基线 ，我们测量了输出腔室中鱼位位置的解码器的平均解码器误差。
对于所有分析 ，如果没有不同，则仅使用每个实验的最后75分钟进行解码 。在分析解码器误差与包括的细胞数量的函数的分析中（图2F） ，空间调节的阈值逐渐降低直到获得10,000个细胞（n = 7 Fish） 。因此 ，在远科脑中有记录的细胞少于10,000个鱼类被排除在此分析之外。为了避免循环，对于图3D ，在实验的第一个和最后30分钟内分别计算了改组的特异性z评分和种群z得分 。因此 ，对这两次窗口的解码是基于每个窗口中各自的顶级PC的基础 。
我们发现，非冗余解码器开始使用17个单元格中的所有单元格优于解码器。使用所有单元格的解码器的性能较差是简单的线性解码器设计的结果，该设计均等重视所有单元的信息 。因此 ，较少的特异性神经元会影响解码器 ，并稍微恶化结果 。但是，该解码器的优点是模型的有限假设 ，易于解释性和不适合的可能性。
我们使用普通的最小二乘回归来测量可以通过不同的行为变量（包括物理位置 ，标题和速度）来解释位置编码细胞活动中的多少方差 。与使用广义线性模型56相比，这是一个简单得多的模型 。将行为变量离散到垃圾箱中 ，并在模型中添加每个垃圾箱的指标函数。回归模型可以通过以下公式总结：
在时间t ，细胞N的基线验证的神经活性代表基线活性，代表鱼的物理位置的贡献 ，是空间bin i在时间t时的活性 ，L是空间垃圾箱的数量（15×8 = 120），代表了鱼的临时贡献 ，是在时间t中贡献的临时活动。鱼类的活性是速度t和s = 24的速度bin的活性 。为了比较单独和共同的空间位置 ，标题和速度的贡献，我们在四种情况下测试了普通最小二乘的回归：（也就是说，只有空间指示器函数）（也就是说 ，只有标准指示器功能） ，（即仅具有速度指示器功能），最后 ，完整的方程式如上所示 。所有模型均均对参数的弱L2正则化 ，罚款系数为1-10。对于每个回归模型，我们报告了在扩展数据中显示的远程脑PC中R2值的结果分布 。图1B 。同样 ，在扩展数据中显示了其他脑脑细胞中R2值的分布图1c。应用了基于运动速度的标准排除标准（请参阅“识别PC ”中的空间活动图） 。
在所有FISH到同一参考FISH52的PC的位置投影后 ，我们将所有PC累积到三维直方图中，代表参考量内每个三维箱中检测到多少个PC 。然后 ，我们用半径为5 µm的球形卷积掩模进行了三维直方图 ，因此每个位置编码的细胞对5 µm半径内的所有垃圾箱的增量贡献了一个计数。然后计算最大强度投影以从多个视图中可视化解剖分布（图1F） 。
为了搜索其发射特性遵循BVC Model34的细胞，我们将BVC模型（见下文）拟合到端脑中的候选神经元 。该模型预测这些细胞的活性F将根据每个边界点（相对于动物的极坐标为r和θ表示）。
其中表示相对于优选的射击方向ϕ和距离边界距离D的发射速率：
在这里 ，分别是径向和角度调节的宽度 。与原始的Model34相比 ，该变量是线性依赖于D的变量，我们将其视为拟合的常数 。A是缩放因子，C是基线。请注意 ，该实验的空间活性图的bin尺寸稍小（侧长1.1 mm） ，以确保足够的分辨率以准确检测和表示插入的壁。将模型拟合到空间活动图时，我们首先通过其标准偏差将图归一化 。在拟合期间 ，我们将d限制为0到10箱之间（假设BVCS大火接近边界） ，在-π和π之间，在0到10之间 ，在0到10之间 ，a介于0到100至1之间，在-10至+10活动单位之间 。
为了测试给定神经元的活性是否由BVC模型预测 ，我们进行了三节实验（在基线疗程（45-95分钟）之后 ，引入了S2的内壁（45-95分钟）（45-95分钟），并在S3（45-95分钟）中删除（45-95分钟）（扩展数据图3B）。我们首先确定了所有通过最低特异性标准的细胞（所有三个课程的每个活动单元超过0.01位） 。鉴于插入壁的方向 ，只有与插入的壁平行的PFS（S1和S3中的PFS）是平行于插入的壁的细胞（从-45°至45°或135至225°）是BVC分析的合适候选者 。然后 ，我们将BVC模型拟合到S1中这些候选细胞的空间活性图上，然后使用拟合模型在会话之间生成预测的活动图（有或没有壁插入）。
我们使用拟合模型生成的预测活动图计算了观察到的空间活动图之间的Pearson相关系数 。为了测试Pearson相关系数的重要性，我们将观察到的空间活性映射到大约1,100次（与地图中的箱数相同） ，并重新计算了每个置换量的Pearson相关系数 ，以构建一个零分布的零分布，以用于单方面的shuffle测试 。
至关重要的是 ，BVC模型预测了S2中PFS的重复。在S1和S3中 ，预计该重复的射击场将不存在，预计具有相同的空间活动图 。因此 ，要归类为BVC ，一个细胞必须与所有三个会话中的BVC模型一致：
为了量化PFS在各个会话之间保持潜在的聚类的程度，我们对每个神经元进行了邻域分析（图6E） 。首先 ，对于每个神经元 ，我们通过与S1感兴趣的神经元相关的所有其他神经元对所有其他神经元进行了排名。我们将PF相关性最高的神经元定义为邻居，其中包含阈值从前2％到顶部100％ 。我们将邻居保留％定义为S2中仍然是邻居的神经元的数量除以S1中的原始邻居数 。然后绘制所有远程脑PC的平均邻居保留％。该分析还针对PF接近边缘的细胞（COM到边缘至3 mm或更小）的细胞 ，以及其射击场远离边缘的细胞（到边缘最接近3 mm的距离）。为了避免不完美的细胞合并的任何潜在贡献 ，我们将此分析限制为最小解剖距离超过20 µm的细胞对 。使用单方面的Wilcoxon签名级测试来量化实验中的邻居保留％是否比会议内的阳性对照（S1的早期和后期之间的比较）明显差 。作为阴性对照，我们在第二节中将细胞指数改组了1,000次，以随机化神经元之间的关系。在洗牌后 ，我们计算了从任何一个会话中所有远程脑PC中的平均邻居保留％ ，以生成无效分布（即洗牌控制） 。通过计算平均邻居保留％高于洗牌对照的洗牌百分比来计算P值 。对于这些显着性测试，我们将最高相关邻居的数量固定为10％。
Wilcoxon签名的秩检验用于样本量相等的配对位置比较 。Mann – Whitney U检验用于未配对的位置比较 。
实验是根据Tübingen大学和Regierungspräsidium的动物福利办公室进行的。矩形腔室和ABA实验的所有实验在后6-9天后使用Nacre（Mitfa - / - ）的TG（Elavl3：H2B-GCAMP6S+/+） 。其余的实验在后6-13天使用TG（Elavl3：H2B-GCAMP8S+/+或GCAMP8S +/-）与NACRE（MITFA - / - ）在植入后6-13天 。在三个矩形到圆形实验中 ，鱼类表达了TG的额外等位基因（Elavl3：gcamp6s）。在25°C下以14/10 h的光/黑暗周期饲养鱼 。它们被维持在E3水中的30组中 ，每天喂养干粮 。
跟踪显微镜由带有GEFORCE RTX 3080 TI图形处理单元的架子安装的12核工作站控制。使用八个机架，8至16核Linux服务器进行离线数据分析 ，每个架子均具有四个图形处理单元（GEFORCE RTX 3080 TI ，RTX 2080 TI或GTX 1080 TI），或在Max Planck Computing和Data Instaries（Raven ，A100-SXM4）上进行。
有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得 。
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