在2020年12月14日至2021年2月10日，在Addenbrooke的医院连续招募的社区参与者或医护人员 ，他们在2020年12月14日至2021年2月10日之间接受了BNT162B2疫苗的第一剂。在接受第二剂BNT162B2疫苗后
，参与者最多跟踪了3周 。他们在第一次剂量后3至12周提供了血液样本，第二次剂量后3周提供了血液样本
。连续参与者符合条件而没有排除。利息的暴露是年龄的 ，分为两个暴露水平（<80年和≥80岁） 。感兴趣的结果是至少在首次剂量后至少3周
，疫苗吸收的血清抗体中和活性不足
。这是在体外中和测定中抑制50％（ID50）所需的血清所需的血清稀释度。ID50为20或以下是中和的不足 。通过基于多重粒子的流式细胞仪测量了对尖峰，受体结合结构域（RBD）和核素的结合抗体反应 ，并通过IFNγ和IL-2荧光谱分析测量了多重粒子的流式细胞仪和峰值特异性T细胞反应
。第一次疫苗剂量后
，血清自身抗体的测量和B细胞受体（BCR）库的表征是探索性结果。 　　我们假设≥80年组的非中和化的风险比与<80年的5年组相比 。使用α为0.05，功率为90％ ，每组的样本量为50
，每组1：1的比例为1：1
。 　　该研究得到了英格兰东部 - 剑桥中央研究伦理委员会（17/ee/0025）的批准。NIHR Bioresource Center Cambridge先前通过ARIA研究（2014- 2016年）招募的未暴露志愿者的PBMC在剑桥人类生物学研究伦理委员会（HBREC.2014.07）和目前的苏格兰研究伦理北部委员会1（NS/17/17/0110）的伦理批准中使用了 。 　　分类时，当连续 ，频率和比例（％）时，人口统计学和临床​​数据的描述性分析以中位数和IQR表示。连续数据和分类数据之间的差异分别使用Wilcoxon等级总和和卡方检验进行了测试
。Logistic回归用于模拟年龄组与BNT162B2疫苗首次剂量后通过疫苗吸引的抗体中和之间的关联。随着混杂因素的调整
，从疫苗接种到采样的性别间隔的影响 。线性回归还用于探索年龄作为连续变量和对数转换ID50，结合抗体水平 ，抗体亚类水平和剂量1后T细胞反应的关联
，并在BNT162B2疫苗的剂量1和剂量2后进行T细胞反应
。在结合抗体水平，ID50 ，年龄和T细胞反应之间的线性相关分析中进行了多次比较
，进行了Bonferroni调整。据报道，Pearson的线性数据正常分布相关系数和Spearman的非线性数据的非正态分布相关系数 。使用Stata V13 ，Prism V9和R（版本3.5.1）进行统计分析
。 　　野生型伪型病毒（轴承突变D614G）
，b.1.1.7伪型病毒（轴承突变Δ69/70，Δ144 ，Δ144
，N501Y，A570D ，A570D，D614G
，d614g，p681H ，p681H
，p681H，p681H ，p681h
，t716i and t716i and t716i and s982a and B.11118H）mutations L18F, D80A, D215G, Δ242-4, R246I, K417N, E484K, N501Y, D614G, A701V) and P.1 pseudotyped virus (bearing mutations L18F, T20N, P26S, D138Y, R190S, K417T, E484K,生成了N501Y，D614G ，H655Y
，T1027I和V1176F）。简而言之，根据制造商的说明（Agilent Technologies） ，使用Quikchange Lightening位置定向的诱变试剂盒（Agilent Technologies）
，将氨基酸取代引入了D614G PCDNA_SARS-COV-2_S质粒中，如前所述23 。通过Sanger测序验证序列
。The pseudoviruses were generated in a triple plasmid transfection system whereby the spike-expressing plasmid along with a lentviral packaging vector (p8.9) and luciferase expression vector (psCSFLW) were transfected into 293T cells (a gift from Greg Towers; tested for mycoplasma) with Fugene HD transfection reagent (Promega).48小时后收获病毒 ，并在-80°C下储存。TCID50通过在表达ACE-2和TMPRSS224的293T细胞上的病毒滴定确定 。 　　峰值假型测定法具有与使用完全感染性的野生型SARS-COV-211相似的中和测试的特征
。使用SARS-COV-2峰值伪型型病毒，对ACE2和TMPRSS2瞬时转染的293T细胞进行病毒中和测定。将伪型病毒与热灭活的人血清样品的连续稀释液或在37°C的复印件中从接种疫苗的个体中孵育1小时 。还包括病毒和仅细胞对照。然后
，将新鲜胰蛋白酶的293T ACE2/TMPRSS2表达细胞添加到每个井中
。在37°C下与5％CO2孵育48小时后，使用稳定的GLO荧光素酶测定系统（Promega）测量发光。相对于仅病毒对照计算中和 。稀释曲线作为S.E.M.的平均中和表示
。ID50值是在GraphPad Prism中计算的。50％中和的检测限为ID50为20 。组内的ID50被总结为几何平均滴度（GMT） ，并且组之间的统计比较与Mann -Whitney或Wilxocon排名符号测试进行了统计比较
。 　　接种前24小时
，在96孔板中，将A549-ACE2-TMPRSS2细胞以每孔2.4×104的细胞密度接种。血清从最终稀释的1:50开始 ，活体B.1病毒PHE2（EPI_ISL_407073）分离株以0.01的感染（MOI）添加 。然后将混合物孵育1小时
，然后再添加到细胞中
。感染72小时后，用8％甲醛固定板 ，然后用coomassie蓝色染色30分钟。在使用celigo成像细胞仪（Nexcelom）之前对板洗涤并干燥过夜
，以测量染色强度 。通过将染色的强度与未感染的井进行比较，确定细胞存活率百分比
。使用非线性Sigmoidal 4PL模型（GraphPad Prism 9）来确定每种血清的IC50。使用线性回归探索了从假病毒获得的对数转换的ID50与活病毒系统的相关性 。确定了皮尔逊的相关系数。 　　重组SARS-COV-2核素 ，尖峰和RBD共价耦合到不同的羧化珠套件（Luminex）
，形成3个质子，并如前所述进行了分析
。据报道特异性结合是平均荧光强度（MFI）。 　　根据制造商的说明 ，使用IgG酶连接的免疫吸附测定（ELISA），HCMV Captia（Trinity Biotech）根据制造商的说明确定了HCMV IgG水平 。 　　根据制造商的说明
，使用Protoplex自动免疫面板（Life Technologies）对血清进行自身抗体的存在
。简而言之，将2.5μl血清与Luminex magplex磁性微球孵育 ，以连接到19个全长人体自身抗原（Cardiolipin
，Cenp B，H2A（F2A2）和H4（F2A2）和H4（F2A1） ，JO-1
，JO-1，LA/SS-B ，MI-2B
，MI-2B，Myelporase蛋白酶 ，蛋白酶的蛋白酶
，复合物，RO52/SS-A ，SCL-34，SCL-70
，Smith Antigen，甲状腺球蛋白 ，甲状腺过氧化物酶
，转谷氨酰胺酶，U1-SNRNP 68和整个组蛋白）以及牛血清白蛋白（BSA）。使用96孔平底板中的山羊 - 抗 - 人类IgG-RPE进行检测 ，并在Luminex XMAP 200系统中读取板 。在log2转换和阈值之前
，在每种抗原的背景校正总FI中，从R（版本3.5.1）中进一步处理了原始的荧光强度（FI）
。每个分布中的离群值（Q3+1.5×IQR）定义为正值。 　　根据制造商的说明 ，使用经过验证的电化学三明治测定试剂盒（中尺度发现VPLEX）对血清蛋白进行定量 。In brief, both sera and standard calibration controls were incubated with SULFO-tagged antibodies targeting IFNγ, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TNFα, GC-CSF, IL-1α, IL-12, IL-15, IL-16, IL-17A, IL-5,IL-7
，TNFβ，VEGF ，MCP1
，MCP4，Eotaxin ，Eotaxin3，IP10
，MDC，MDC ，MIP1α
，MIP1β，TARC ，IL-17B
，IL-17B，IL-17C ，IL-17D
，IL-17D，IL-17D ，IL-1RA
，IL-1RA，IL-1RA ，IL-3，IL-3
，IL-9，IL-9 ，IL-9
，IL-9，TSLP ，VEGFA
，VEGFA，VEGFA ，VEGFC
，VEGFF，vegff ，vegff.TIE2
，FGF，ICAM1 ，VCAM1，SAA和CRP
，并使用MSD Meso S600仪器阅读
。通过与安装到四参数逻辑模型的内标校准曲线进行比较来计算浓度。低于（19％）或以上（0％）的值分别在检测的下限/上限下估算参考范围 。每个细胞因子水平与SARS-COV-2中和抗体滴定，中和状态（1/0）和年龄的关联是使用Kendall的Tau和Wilcoxon测试进行的 ，而FDR <5％被认为是重要的
。 　　根据制造商的协议
，使用QIAGEN ALLPREP DNA/RNA MINI套件和AllPREP DNA/RNA微型套件裂解PBMC并提取RNA。使用量子量化RNA 。B细胞受体库库为52个COVID-19的疫苗接种个体（58个样本）生成：从PAXGENES（14μl体积）中的200 ng总RNA与1μl10mm DNTP和10μM反向引物混合物（2μL）和10μm反向引物混合（2μL）合并，并在70°C下孵育5分钟。立即将混合物放在冰上1分钟 ，然后与1μLDTT（0.1 m）
，1μl上术（Thermo Fisher Scientific），4μLSSIV缓冲液（Thermo Fisher Scientific）和1μLRNaseRNase抑制剂合并
。将溶液在50°C下孵育60分钟 ，然后在70°C下灭活15分钟。用AMPURE XP珠清洁cDNA
，并使用KAPA方案和以下热循环条件清洁PCR-5'V-Gene多路复用引物和3'通用反向引物：1循环（95°C，5分钟）；5个周期（98°C ，20 s; 72°C
，30 s）;5个循环（98°C，15 s; 65°C ，30 s; 72°C，30 s）;19个周期（98°C
，15 s; 60°C，30 s; 72°C ，30 s）;1步（72°C
，5分钟） 。使用Illumina协议制备测序库，并在Miseq机器上使用300 bp配对的测序进行测序
。 　　使用PHRED得分≥32（http://sourceforge.net/projects/quasr/） ，对原始读取的基础质量进行过滤。在存在至少20 bp相同的重叠区域的情况下
，向前和反向读数合并 。在所有具有相同条形码的序列之间存在超过80％的基本序列相似性的情况下，将序列保留
。具有最高序列相似性的常数区域等位基因通过10-Mer匹配与IMGT数据库的参考常数区域基因匹配来鉴定。除去没有完整读取帧和非免疫球蛋白序列的序列被除去 ，并且仅保留了与IMGT数据库中的参考IGHV和J基因显着相似的读取 。在IMGT V-Quest中进行了免疫球蛋白基因的使用和序列注释
，并通过Python中的自定义脚本分析了曲目差异
。 　　通过相同的IGHV和IGHJ段注释收敛的克隆，具有相同的CDR-H3区域长度 ，并基于85％CDR-H3序列氨基酸同源性聚集。如果群集包含来自疫苗后个体和数据库的序列
，则将其视为与COV-ABDAB数据库收敛 。 　　The following antibodies or staining reagents were purchased from BioLegend: CD19 (SJ25C, 363028), CD3 (OKT3, 317328), CD11C (3.9, 301608), CD25 (M-A251, 356126), CD14 (M5E2,301836), and IgM (IgG1-k,314524）
。CCR7（150503，561143）和IgG（G18-145 ，561297）从BD Bioscience，CD45RA（T6D11
，130-113-359）的BD Bioscience获得，来自Miltyeni Biotech ，CD8A和CD8A和CD8A（SK1
，48-0087-42）。可实时/死固定的水上死细胞染色套件是从Invitrogen获得的 。如先前所述26的生物素化尖峰蛋白与链霉亲和素R-磷酸蛋白（PJRS25-1）或从Agilent Technologies获得的链霉亲和蛋白APC相连。从研究参与者中分离出PBMC并存储在液氮中
。将含有107个细胞的等分试样解冻，并在4°C下用上述抗体面板染色2 mM EDTA ，然后在PBS中转移至0.04％BSA。在Facsaria Fusion（BD Biosciences）上获得了事件 。分析是在Flowjo版本10.7.1中进行的
。 　　使用Histopaque-1077（Sigma-Aldrich）和Sepmate-50管（Stemcell Technologies）从肝素化的血液样本中分离PBMC。将冷冻的PBMC迅速解冻
，并将其稀释为10 mL Texmacs培养基（Miltenyi Biotech），离心并重悬于10 ml新鲜培养基中 ，含10 u/ml DNase（苯并酶
，Merck-Millipore，通过Sigma-Aldrich） 。然后将PBMC在37°C下孵育1小时 ，然后在被计数之前在补充5％人类AB血清（Sigma Aldrich）的新鲜培养基中进行离心
，然后重悬于
。PBMC用2μL活/死固定的远红色细胞染色套件（Thermo Fisher Scientific）染色，并在BD精确的C6流式细胞仪上列举了活PBMC。 　　使用以下以下内容生成肽池：1 。肽sars-cov-2 prot_s包含序列域（氨基酸）304–338 ，421–475，492–492-519
，683–707，741-7770 ，741–770SARS-COV-2（GenBank MN908947.3
，蛋白质QHD43416.1）
。2。含有氨基酸的肽SARS-COV-2 PROT_S1 1-692 。所使用的肽是15种具有11-氨基酸重叠的氨基酸
。 　　We incubated 1.0 to 2.5 × 105 PBMCs from vaccinated individuals in pre-coated FluoroSpotFLEX plates (anti-IFNγ and anti-IL-2 capture antibodies, Mabtech) in duplicate with the spike peptide pool mix as described above (specific for Wuhan-1, QHD43416.1 spike SARS-CoV-2 protein; Miltenyi Biotech) or a mixture of针对巨细胞病毒，爱泼斯坦 - 巴arr病毒和流感病毒（CEF+ ，Miltenyi Biotech）的肽（制造商建议的最终肽浓度：1μg/ml/肽）除了未刺激（培养基）和阳性对照组合（MABIN-CD33（MABECECT））（Mabinbin BBIN）（Mabectyb）（Mabectyb）（MABECTECT 3）Sigma aldrich））在37°C下在加湿的二氧化碳气氛中持续42小时。然后将细胞和培养基从板上倒下
，并根据制造商的说明进行测定 。使用AID ISPOT读取器（牛津生物系统）读取开发的板，并使用AID ELISPOT V7软件（Autoimmmun Diagnostika）进行计数。通过减去背景细胞因子特异性斑点（未刺激的对照）来计算肽特异性频率 ，并以每106个PBMC表示为SFU
。使用相同的肽池
，我们还刺激了在2014年至2016年之间收集和生物群体的PBMC，代表了尚未暴露于SARS-COV-2的健康人群 ，并从SARS-COV-2感染了SARS-COV-2（由RT – PCR证实）的供体的PBMC（由RT – PCR证实）
，以比较自然感染后T细胞反应反应。 　　根据制造商的说明，使用抗CD4或抗CD8直接珠（Miltenyi Biotec） ，通过磁性激活的细胞分选（MAC）将外周血单核细胞耗尽CD4+或CD8+ T细胞 。通过用CD3-FITC，CD4-PE和CD8-PercpCy5.5抗体（所有Biolegend）染色细胞并通过流式细胞仪分析来确定耗竭的效率
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然研究报告摘要中获得。
http://http://www.o-press.com/news/show-96.html/sitemaps.xml http://http://www.o-press.com/news/show-60.html/sitemaps.xml http://http://www.o-press.com/news/show-359.html/sitemaps.xml http://http://www.o-press.com/news/show-135.html/sitemaps.xml http://http://www.o-press.com/news/show-146.html/sitemaps.xml http://http://www.o-press.com/news/show-355.html/sitemaps.xml http://http://www.0517kq.com/news/show-8088.html/sitemaps.xml http://http://www.0517kq.com/news/show-8142.html/sitemaps.xml http://http://www.o-press.com/news/show-292.html/sitemaps.xml http://http://www.o-press.com/news/show-32.html/sitemaps.xml