先前描述并验证了这项研究中的臀部细胞2,3。从三个健康个体和三个具有TS的成纤维细胞中得出了总共六个臀部细胞系 。该研究的批准是从斯坦福IRB小组获得的，并获得了所有参与者的知情同意
。ISEGENIC TS1（G406R）线通过指导RNA靶向GGTGTGTGCTTAGCGG和同源修复模板Ssodn ，通过核反射在Kolf2.1臀部细胞系中得出。aggaatagcagaaagaaataaaaaaaaaaaaataaaaaaaaaaaaatcaagacttttttttccttggtcctgcttccttacctgctaagcaccaccaccaccgagaaccaagtaagtaagtac33 。CW30293臀部细胞系从CIRM获得。通过Sanger测序证实了杂合突变的存在
。hiPS cells were cultured in feeder-free essential 8 medium (E8, Thermo Fisher Scientific, catalogue no. A1517001) without antibiotics and kept in the wells of six-well plates (Corning, catalogue no. 3506) coated for 1 h at room temperature with vitronectin recombinant human protein (VTN-N, Thermo Fisher Scientific, no. A14700) diluted 1:100 to a final在Dulbecco的PBS（DPB）中
，浓度为5 ng ml -1，既没有钙也不是镁（Thermo Fisher Scientific ，CatalogNo。14190136） 。为了促进传播，首先将臀部细胞用DPB洗涤
，然后在室温下在DPBS中与0.5 mm EDTA（Invitrogen，目录号15575020）一起孵育7分钟
。去除EDTA溶液后 ，将细胞在涂有VTN-N并含有E8培养基的六孔板的新鲜孔中播种。这项研究中使用的臀部细胞在37°C下在37°C的空气中保持了分枝杆菌
，并在5％CO2的加湿空气中保持 。Lenti-X 293T细胞系是HEK293T细胞的亚克隆，从Takara Bio（目录No.632180）中获得 ，并在DMEM（Gibco
，CatalogNo
。10313021）中培养，补充了10％的胎牛血清（Cornog no.35016cv） ，并补充了10％的胎牛血清（CornogNo。35016cv）（Cornog no.35016cv）（cornog catalog No. 35016cv）否 。35050061）
。之所以选择该细胞系
，是因为它与可靠的质粒过表达兼容。 　　如前所述3,34,35进行了HCO，HSO和HFA的产生 。简而言之 ，将臀部细胞与ACCUTASE（Innovate Cell Technologies
，No
。At-104）在37°C孵育7-8分钟，并分离为单个臀部细胞。将单细胞悬浮液收集在50 mL猎鹰管中 ，并通过300克离心3分钟获得的细胞颗粒 。重新悬浮细胞颗粒后对细胞数进行计数。在2 mL的E8培养基中，大约3×106个细胞
，这些E8培养基补充了抑制剂Y-27632（10μM，SelleckChem ，CatalogNo
。S1049）的每孔（Stemcell 800板）（Stemcell Technologies
，Catalog No.34815）。然后将板以100克离心3分钟，以使细胞沉入孔的底部（第0天） 。Twenty-four hours following cell aggregation (day 1), spheroids were dislodged by pipetting (with a P1000 tip cut at the end) and transferred to ultralow-attachment plastic dishes (Corning, no. 3262) in essential 6 medium (E6, Life Technologies, no. A1516401) supplemented with 2.5 μM dorsomorphin (Sigma-Aldrich, catalogue no.p5499）和10μmSB-431542（Tocris ，目录编号1614）
。从第2天到第6天
，每天更改E6培养基，并补充了背酚和SB-431542。另外 ，加入了Wnt途径抑制剂XAV-939（XAV
，1.25μM，Tocris ，CatalogNo 。3748）
，以及后型和SB-431542
。在第七天，悬浮暂停的第七天 ，基础培养基被切换为神经A（Life Technologies，CatalogNo。10888）
，没有维生素A（B-27，Life Technologies ，CatalogNo 。12587）
，谷胱甘木马（1：100，Life catalog no.35050）的神经培养基（第10888号目录） ，B-27补充
。（Gibco
，目录号15140122）。从第6天到第24天，对神经培养基进行了20 ng -1表皮生长因子（EGF ，R＆D系统
，目录编号236-EG）和20 ng ml-1的基本成纤维细胞生长因子（FGF，R＆D系统 ，目录No 。233-FB）
，直到19天（直到第24天），为期19天 ，持续19天（直到第24天）， 从每天的第7-18天到每天的介质
，到第24天
。从第43天开始，HCO仅使用没有生长因素的神经培养基进行培养。HSO的产生与HCO的产生不同 ，在第7-12天
，除了EGF和FGF之外，神经培养基还补充了XAV（1.25μM） 。从第13-24天开始 ，除EGF和FGF外
，还补充了XAV（1.25μm）和SAG（100 nm，EMD Millipore ，CatalogNo。566660）的SAG（100 nm
，EMD Millipore）
。 　　使用磷酸座主链和MOE修饰，将ASOS合成20 nt长。在合成过程中使用5-甲基胞嘧啶而不是胞嘧啶 。通过标准脱盐 ，然后进行Na+盐交换
，纯化了在臀部细胞衍生的前脑器官上测试的ASOS
。将这些ASO在无核酸酶的水中以1 mm的浓度重构，然后在-20°C下存储以进行体外实验。对于体内注射 ，将ASO.14以10μgμl -1的浓度在DPB中重组，以注射30μl的300μgASO中的300μgASO中的大鼠甲壳虫含量 。这项研究中使用的所有ASO均由集成的DNA技术制造
。通过向ASO的5'添加Cy5（集成DNA技术）
，然后进行HPLC纯化和Na+盐交换来合成Cy5标记的ASOS。 　　PDUP4-1从addgene（质粒编号23022）获得，并用作微型剪接报告基因的骨架 。PDUP4-1用APAI和BGLII（新英格兰Biolabs）消化 ，并使用Qiaquick PCR纯化试剂盒（Qiagen
，Catalog No.28106）在1％琼脂糖凝胶上加载后，纯化了4,595 bp的片段
。用Dneasy血液和组织试剂盒（Qiagen ，CatalogNo。69506）纯化来自TS臀部细胞的基因组DNA 。用GoTaq Long PCR Master Mix（Promega
，CatalogNo
。M4021）扩增了包含Cacna1c的外显子8和8A的扩增子。在补充表1和2中列出了引物序列和循环条件 。用APAI和BGLII消化了纯化的PCR产物。在另外一轮纯化之后，将DNA用FastAP热敏碱性磷酸酶（Thermo Fisher Scientific ，CatalogNO
。EF0654）去磷酸化
，然后使用T4 DNA Ligase（Thermo Fisher Scientific，Catalogno。El.El.El.El.0011）连接到PDUP4-1骨架 。转化后（一杆STBL3化学能力的大肠杆菌 ，Thermo Fisher Scientific
，CatalogNo
。C737303），选择了菌落进行序列验证。人PTBP1 ORF质粒是从Genscript获得的（克隆ID OHU15891D ，登录号NM_002819.5） 。编码WT和TS CAV1.2的质粒由载体构造器基于转录本eNST00000399655.6在CAG启动子下在慢跑病毒主链中合成
。HA标签放在Q683和T684之间。GCAMP质粒是从addgene获得的（质粒编号111543） 。先前描述了编码L型钙通道的β1b和A2δ亚基的质粒
。在补充图2中包括小型剪接记者和人CAV1.2表达质粒的地图和序列。3–6（由Snapgene 5.1.4.1生成，来自Dotmatics的Snapgene软件） 。 　　对于所有样品
，使用Rneasy Plus迷你试剂盒（Qiagen，CatalogNo
。74136）提取RNA。除非另有说明 ，否则根据制造商的说明
，使用QRT-PCR的Superscript III第一链合成超级物（Invitrogen，CatalogNo 。11752050）进行逆转录。使用SYBR Green PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific ，CatalogNo
。4312704）
，在QuantStudio 6 flex实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，Catalog No.4485689）上进行了QPCR。QPCR的引物在补充表1和2中列出 。 　　CACNA1C外显子8和8A的限制片段长度多态性分析对从cDNA扩增的PCR片段进行
。根据制造商的说明 ，使用Ampure XP珠（Beckman Coulter
，CatalogNo。A63881）纯化DNA 。将纯化的DNA用BAMHI（Thermo Fisher Scientific，目录编号ER0055）在37°C下消化3 h ，并在2％琼脂糖凝胶上加载
。凝胶图像是在凝胶DOC XR+成像仪上拍摄的（Bio-Rad
，CatalogNo。1708195） 。为了对转录本进行下一代测序分析，使用Illumina适配器的底漆用于扩增包含外显子7-9的区域
。珠纯化后 ，将DNA在水中洗脱并使用Genewiz Amplicon-EZ模块进行测序。通过在转染后3天从转染的HEK细胞的cDNA扩增微型转录物，对小型剪接报告基因进行了下一代测序分析 。补充表1和2中列出了引物和循环条件
。 　　将大约30,000–75,000个HEK细胞每孔接种24孔板（Corning
，目录，第353047号）。第二天 ，将质粒与150 mM NaCl溶液中的50μl50μL中混合质粒（Polysciences
，PolySciences，CatalogNo 。24765-1）。在大约10 s的剧烈涡旋后 ，将质粒混合物在室温下孵育15分钟
，然后添加到井中（补充表3-5）
。 　　如先前所述进行了HCO对单层培养的解离，并进行了少量优化4。将盖玻片涂在约0.001875％聚乙烯亚胺（PEI ，Sigma-Aldrich
，目录No 。03880）的37°C下1小时，用水洗涤四次并干燥
。在解离的那天 ，将每个髋关节细胞系的四分之一和六个HCO转移到六孔板中的井中（康宁
，目录，第3506号） ，并在37°C的37°C下孵育45-60分钟。This solution consisted of 30 U ml−1 papain (Worthington Biochemical, catalogue no. LS003127), 1× EBSS (Millipore Sigma, catalogue no. E7150), 0.46% (+)-glucose, 0.5 mM EDTA, 26 mM NaHCO3, 10 μM Y-27632, 125 U ml−1 deoxyribonuclease I（Worthington生化，目录号LS002007）和6.1 mm-半胱氨酸（Millipore Sigma
，目录号C7880） 。木瓜蛋白酶孵育后，将样品收集在15 mL猎鹰管中 ，并以1,200 rpm离心1分钟
。去除上清液后
，用2％胰蛋白酶抑制剂（沃辛顿生化，目录号LS00308）用1 mL抑制剂溶液洗涤样品 ，并重悬于1 ml的相同溶液中以进行三固化。创作后
，在细胞悬浮液下缓慢加入1 ml用4％胰蛋白酶抑制剂的抑制剂溶液，以形成梯度层 。然后将梯度溶液以1200 rpm离心5分钟
。将细胞颗粒重悬于由补充B-27和10μMY-27632的神经脂肪A组成的培养基中。通过将细胞悬浮液通过40μM细胞过滤器（Corning ，CatalogNo 。352340）通过细胞悬浮液来去除未分离的组织
。最后
，将分离的细胞在1 ml培养基中的每个盖玻片的密度为50,000个细胞的密度在盖玻片上播种。抑制剂溶液与酶溶液不同，因为它既不包含木瓜蛋白酶也不包含EDTA 。所有离心步骤均在室温下进行。 　　如前所述26 ，对单层HCO细胞上的Fura-2钙成像进行了
。In brief, cells were loaded with 1 mM Fura-2 acetoxymethyl ester (Fura-2 AM, Invitrogen, no. F1221) for 30 min at 37 °C in NM medium, washed with NM medium for 5 min and then transferred to a perfusion chamber (RC-20, Warner instruments) in low-potassium Tyrode’s solution (5 mM KCl, 129 mM NaCl, 2 mM CaCl2,1 mM MGCL2
，在倒荧光显微镜（Eclipse TE2000U，尼康）的阶段 ，葡萄糖，25 mm HEPES pH 7.4）。在基线成像0.5分钟之后
，将高硫糖的溶液灌注1分钟 。在室温（25°C）上进行成像，并在配备有激发滤轮和自动阶段的表层显微镜上进行成像
。如前所述 ，如前所述20
，使用OpenLAB软件（PerkinElmer）和Igor Pro（V.5.1，Wavemetrics）以大约1 Hz的成像速率收集和量化延时激发340：380-nm-Ratio图像。残留钙的计算为（c -a）/（b - a） ，其中a是基线值（第五帧）
，b是去极化后的峰值（手动确定）后的峰值，而C是衰减值（B+25帧） 。 　　对于GCAMP成像 ，将HEK293T细胞接种在24孔板中
。第二天
，将细胞用质粒的混合物（包括亚基CAV1.2β1b，α2δ和α1和α1和GCAMP6-X）转染（补充表3）。转染后三天 ，用SP8共聚焦显微镜（Leica Microsystems）以1.2875 s的框架间隔进行成像 。在成像之前
，将细胞培养基替换为500μl的5 mm泰罗德溶液
。在基线成像30 s之后，加入了500μl的129毫米Tyrode溶液（最终浓度为67 mM KCl）。 　　类似地 ，对于二维神经元中的GCAMP成像，TS和WT HCO分离为24孔成像板（Cellvis P24-0-N）
，并被AAV-DJ-HSYN1 :: GCAMP6F感染（基因载体和病毒核心，Wu Tsai Neursciences Institute ，Stsai Neursciences Institute
，Stanford University，Stanford University） 。将各种浓度的ASO（ASO.14 ，ASO.17
，ASO.18和ASO.SCR）应用于解离神经元
。10天后，使用SP8共聚焦显微镜进行GCAMP成像 ，使用20倍物镜以每框架为1.2875 s）。在成像之前
，将培养基替换为500μl的5 mm泰罗德溶液 。在基线成像30 s之后，加入了500μl的129毫米Tyrode溶液（最终浓度为67 mM KCl）。成像是在总时间为8分钟的时间内获得的
。 　　为了对HEK293T细胞进行GCAMP成像分析 ，使用自定义写入的ImageJ分割宏鉴定了与细胞躯体相对应的感兴趣区域（ROI）。通过施加口罩
，水域和使用“分析颗粒”功能（尺寸为10-1,000，循环0.4-1.0） ，在去极化后的框架（KCL给药后的第五或第六帧）中检测到了ROI 。由于细胞漂移，背景的检测或检测到同一ROI内的一个以上的soma
，因此手动排除了少数ROI的ROI
。为了在神经元中进行GCAMP分析，手动注释了与细胞体的ROI。使用定制写入的R代码对HEK293T细胞和神经元进行下游分析 。将平均灰度值转化为荧光的相对变化：df/f（t）=（f（t）-f0）/f0 ，其中f0代表每个ROI的时间序列的平均灰度值
。如果细胞幅度低于基线平均值或大于20×基线平均值
，则将其排除在外。如上所述计算残留钙值，B表示峰值 ，基线值（峰值框架上游的20帧）和C衰减值（峰值框架后的200帧） 。排除了极端残留钙值（低于-5或高于+5）
。 　　如前所述4
，对与HCO分离的皮质神经元进行了斑块钳记录。4 。HCO在第100-150天解离
。分离后的几天，在解离后1周加入了AAV-DJ-SYN1 :: EYFP和1μMASO的细胞感染。分离后通常在3-4周内进行记录 。将细胞鉴定为EYFP+ ，配备有Infinity2 CCD摄像头和Infinity Capture Software（Teledyne Lumenera）的直立切片示波器显微镜（Scientifica）。用电阻为7-10MΩ的硼硅酸盐玻璃电极进行记录
。对于钡电流记录
，外部溶液中包含100 mM NaCl，3 mM KCl ，2 mM MGCL2
，20 mM BACL2 、25 mm茶-CL，4 mm 4-AP ，10 mM HEPES和20 mm葡萄糖pH 7.4，NaOH和300 MOSM。内部溶液中含有110 mM CSMETHYLSO3
、30毫米茶-CL
，10 mM EGTA，4 mM MGATP ，0.3 mM Na2GTP
，10 mM HEPES和5 mM QX314-CL pH 7.2，CSOH和290 MOSM 。用多机灯700B放大器（分子设备）和Digidata 1550b数字化器（分子设备）获取数据 ，在2 kHz处过滤的低通滤波器
，在20 kHz下进行数字化，并用PCLAMP分析（v.10.6 ，Molecular Devices）
。每10 s对细胞进行每10秒钟的-10 mV超极化（100 ms）进行
，以监测输入并访问电阻。如果细胞显示出30％以上的变化，则将其排除在分析中 。在这项研究中未纠正液体连接电位
。 　　对于钡电流记录 ，在存在四毒素（TTX）（0.5μm）的情况下记录细胞以阻断钠电流
，并在电压夹和去极化电压步骤中保持在-70 mV，并以5 mV的增量为单位（大多数细胞的5 s ，大多数细胞）。从最大电流下2 s的5 s或2-3-s去极化步骤的细胞计算钡电流的失活（大多数为-20至0 mV） 。对于某些细胞，还包括在2 s时灭活的-110 mV（或-100 mV）超极化的记录
。泄漏减法用于最大程度地减少多灯700B中膜耐药性的伪影。I–V curves were fitted in Origin (OriginPro 2021b, OriginLab) with a Boltzmann exponential function: I = Gmax × (V − EBa)/{1 + exp[(V0.5 − V)/K]}, where Gmax is the maximal conductance of calcium channels, EBa is the reversal potential of barium estimated by the curve-fitting programme, V0.5 is the potential for钡电流和K的半最大
，稳态激活是电压依赖性的斜率因子 。 　　对于依赖电压的钡电流灭活，将细胞保持在-70 mV
。用10 mV的增量施用了一系列的预耗压步骤（3 s） ，从-110或-100至+40 mV。然后对电压步骤（-10或0 mV
，记录最大电流）进行测试，然后再进行另外1-3 s 。从第一个测试脉冲开始 ，将钡电流灭活计算为相对电流到当前幅度的相对电流。依赖电压的灭活曲线在原点上具有指数函数
。 　　将在100-120天分化的TS HCO中解离的细胞将其铺在预上盖板上
，并将其放置在12孔板的井中；然后添加不同浓度的cy5-aso.14。3天后，在室温下首先将盖玻片固定10分钟 ，其中包含一个培养基的溶液和固定缓冲液
，其中包含4％多聚甲醛（PFA）和4％的DPBS中的蔗糖 。接下来，添加了两卷固定缓冲液 ，以额外20分钟
，以最终确定固定步骤
。在用DPB进行两轮洗涤后，将盖玻片孵育1小时 ，阻塞缓冲液由0.3％Triton X-100和用PBS制备的10％正常驴血清组成。去除阻止缓冲液后，添加初级抗体以在4°C下过夜孵育 。抗体CTIP2（ABCAM
，目录号AB18465）和SATB2（ABCAM，目录AB51502）在1：300的阻止缓冲液中稀释
。将盖玻片用DPB洗涤两次 ，然后用二抗孵育（1：1,000阻止缓冲液；驴抗鼠Alexa 488
，Thermo Fisher Scientific，CatalogNo。A-21208； Donkey Antikey Anti Kouse Alti Anti Anti Anti Alti Allexa 568 ，Thermo Fisher Scientific
，Thermo Fisher Scientific，Catalog no.A10037）在室内温度 。在用DPB进行了另外两轮洗涤之后 ，将Hoechst 33258（Thermo Fisher Scientific
，CatalogNo
。H3569）添加到Coverslips 10分钟中，然后将最后一轮用DPBS洗涤。最后 ，使用Aqua-Poly/Mount（PolySciences
，CatalogNo 。18606），将盖玻片安装在幻灯片上（Fisherbrand Superfrost Plus显微镜幻灯片 ，Fisher Scientific，CatealogNo
。12-550-15）。使用20倍物镜使用共聚焦SP8（Leica Microsystems）获取图像 。 　　使用原位细胞死亡检测试剂盒（Roche
，目录编号12156792910）进行TUNEL分析。简而言之，将HCO解离并暴露于1μMASO或炒作对照48小时
。然后将细胞固定在4％PFA中 ，在Triton X-100中透化
，并在37°C下与TUNEL反应溶液一起孵育1小时。用DNase1预处理10分钟的样品用作阳性对照 。在用Hoechst进行冲洗和反染色后，使用20倍物镜使用出色的显微镜成像盖玻片
。将图像缝合在斐济 ，并使用自定义宏来拆分通道
，设置阈值，以通过Hoechst检测核 ，并通过在对照样品上盲目确定阈值来确定CY3+核。 　　For c-Cas3, immunostaining was performed as for Cy5 samples except that rabbit anti-c-Cas3 (Asp175) (1:300, CST, catalogue no. 9661S) and mouse anti-MAP2 antibody (1:100, Sigma-Aldrich, catalogue no. M4403) were used as primary antibodies and donkey anti-rabbit 568 (1:1,000, ThermoFisher Scientific
，目录号A10042）和驴反小鼠Alexa：568（1：1,000，Thermofisher Scientific ，Catalogno 。A10037）作为次要抗体
。使用40倍物镜
，用共聚焦SP8显微镜对盖玻片进行成像。每个盖玻片获得了三到四个字段 。使用具有最大投影，标准化阈值和圆形的斐济分析图像 ，以鉴定细胞（通过Hoechst核染色），然后鉴定C-CAS3+细胞（通过CAS3染色）
。 　　为了染色T-HCO
，将含有T-HCO的新鲜大鼠脑切片切片后，将切片在4％PFA中在4°C下过夜 ，然后用PBS洗涤3次。接下来
，将切片与在室温下阻止缓冲液一起在DPB中与10％正常驴血清和0.3％（体积）Triton X-100一起孵育1小时，然后在4°C的封闭缓冲液中与原代抗体一起孵育（抗HNA ，抗HNA
，小鼠，1：200 ，Abcam
，Abcam，Catalogno 。Ab191181）
。上面描述了用二抗染色的洗涤步骤 ，用二抗染色和染色。 　　将TS HCO与1μMCy5.Aso.14在24孔
，超高连接板（Corning，CatalogNo 。3473）中孵育2天。然后将HCO解散 ，并重悬于含3％牛血清白蛋白和0.5 mM EDTA的200μl染色缓冲液中
。将细胞与或没有PE小鼠抗人CD90（BD Biosciences，CatalogNo。555596
，稀释1：100）一起孵育30分钟 。接下来，使用染色缓冲液进行三轮洗涤步骤 ，并将细胞重悬于200μl染色缓冲液中
，并通过40μM细胞过滤器
。未用CD90染色的未处理的HCO是在习得期间设置栅极的对照。G575和R670分别用于测量PE和CY5信号 。根据该设施的校准说明，在Stanford共享FACS设施的BD ARIA细胞分选仪上进行流式细胞仪
。使用FlowJO 10.7.1软件（BD）处理数据。 　　将源自对照和TS IPS细胞系的HCO等分为24孔 ，超尾板的井（Corning
，CatalogNo 。3473）
。每个孔都包含在2 mL神经培养基中培养的两三个HCO，然后添加1μMASO。在ASO暴露3天后 ，培养基替换了50％
，并在ASO暴露7天后收集的样品 。使用RIPA缓冲液系统（Santa Cruz，CatalogNo
。SC-24948）制备HCO的蛋白质裂解物。通过在1.5毫升管中简要添加50 µL的SDS缓冲液（1.5％SDS ，25 mM Tris pH 7.5）
，制备T-HCO的蛋白质裂解物，然后进行超声处理（QSONICA Q500 Sonicator; pulse 3 s On ，3 s of，3 s off
，幅度20％） 。使用双氨酸酸测定法（Pierce，Thermofisher ，CatalogNo。23225）对蛋白浓度进行定量：将每个泳道的每个样品量20μg蛋白质加载
，并在4-12％Bis-Tris Page凝胶上运行，螺栓4-12％BIS-BIS-TRIS蛋白质凝胶 ，InviteN witter and abox and abox and abbox and
。Dibluoride膜（Immobulin-FL
，EMD Millipore，目录编号IPFL00010）。将膜用5％的牛血清白蛋白与Tris缓冲盐水（TBS-T）（TBS-T）在室温下1小时阻塞 ，并与针对GAPDH的主要抗体（Mouse
，1：5,000，Genetex ，CatalogNo 。Gtx627408）和cavbit
，1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：ACC ACC ACC ACC ACT ACC ACC ACC ACC ACC ACC ACT孵化过夜（鼠标，1：5,000）HCO样品在4°C下进行96小时用于移植样品
。Membranes were washed three times with TBS-T and then incubated with near-infrared fluorophore-conjugated species-specific secondary antibodies—either goat anti-mouse IgG polyclonal antibody (IRDye 680RD, 1:10,000, LI-COR Biosciences, catalogue no. 926–68070) or goat anti-rabbit IgG polyclonal antibody（Irdye 800CW ，1：10,000，Li-Cor Biosciences
，目录号926–32211），在室温下1小时。应用二抗后 ，将膜用TBS-T洗涤3次 一旦使用TBS
，然后使用Li-Cor Odyssey CLX成像系统（LI-COR）成像 。 　　根据制造商的说明，我们使用了人类TLR9记者测定法（Invivogen ，目录号HKB-HTLR9）
。简而言之
，在100 mM细胞培养板上生长了经过修饰的HEK293T细胞，至50–80％的汇合。然后将它们分离在PBS中 ，在Hekblue溶液中以450,000个细胞ML-1重悬于
，并被重复入96孔板中 。将阳性对照暴露于ODN2006（Invivogen，CatalogNO
。TLRL-2006） ，并对无菌水的负面对照。将其他样品暴露于1μMASO
，持续16–24 h 。暴露后，使用单色板读取器（Tecan ，Infinite M1000）和Xfluor 2.0软件通过分光光度计（620–655 nm吸收）检测到TLR9激活
。 　　在分化45-50天后，将HSO与lv.dlxi1/2b :: EGFP慢病毒颗粒在Eppendorf管中的诱导孵育
，并转移到24孔板上。3-7天后，将HSO与补充有1 ml培养基的Eppendorf管中的HCO共同孵育 ，以产生HFA
，然后将其培养在超过24孔板（康宁）的超级跟踪24孔板的单个孔中 。HFA形成后3-4周进行中间神经元迁移的基线成像。接下来，将1μm的ASO添加到HFA中 ，然后在2周后重新映射
。在37°C的共聚焦室内
，在37°C的共聚焦室中，在有5％CO2的混合室内将所有成像进行12-15小时。如前所述进行了盐长度和频率的定量3 。仅包括移动细胞进行分析
。ImageJ用于分析中间神经元迁移。如果HFA在成像过程中移动时 ，则使用线性堆栈对准与SIFT进行校正小移位 。为了估计单个盐的距离
，鉴定出显示soma肿胀的DLXI1/2B :: EGFP细胞，并手动记录了核子后的SOMA新位置的距离（以μm为单位）
。该运动所需的时间用于计算移动时的速度。通常 ，只有显示两个或多个盐分运动的细胞 。 　　根据斯坦福大学实验室动物护理行政小组（APLAC）批准的动物护理指南
，进行了动物程序
。购买了怀孕的RNU rnu rnu/+）大鼠要么购买（Charles River Laboratories），要么繁殖在房屋中。在12/12小时的光/黑暗周期内维持动物 ，并随意提供食物和水 。三到七日大的壁画（FOXN1 - / - ）大鼠幼崽在淘汰前通过未成熟的晶须生长鉴定出来
。将幼崽（男性和女性）用2-3％的异氟烷​​进行了麻醉，并安装在立体定位框架上。在S1上方进行了一个直径约2-3毫米的颅骨切开术
，可保留硬脑膜完整 。接下来，使用30克针（约0.3毫米）刺穿硬脑膜 ，靠近颅骨切开术的侧面。接下来
，将HCO移到一个薄的3×3 cm parafilm上，并去除了多余的培养基
。使用汉密尔顿注射器连接到23克 ，45°针头
，将HCO轻轻拉入针的远端。接下来，将注射器安装在连接到立体静脉设备的注射泵上 。针头的锋利尖端位于硬脑膜（Z = 0 mm）的0.3毫米宽前的穿刺上方 ，并将注射器降低1-2 mm（Z = Z =大约-1.5 mm）
，直到形成针和硬皮植物之间的紧密密封
。接下来，将注射器抬高至z = -0.5 mm的皮质表面的中心 ，并以1-2μlmin -1的速度弹出HCO。在完成HCO注射后
，将针头以0.2-0.5 mm min -1的速度缩回，皮肤闭合 ，幼犬立即将其放在温暖的热垫上，直到完全恢复 。 　　所有动物程序遵循斯坦福大学APLAC批准的动物护理指南
。将大鼠（移植后60天以上）用5％的异氟烷​​进行麻醉
，用于诱导，成像过程中1-3％的异氟烷​​。对于成像 ，一个主动屏蔽的布鲁克7特斯拉水平孔扫描仪（Bruker Corp.）与国际电动公司梯度驱动器
，120毫米内的屏蔽梯度插件（600 mt M-1，1,000 t M-1 s-1 s-1）使用Paravision 6.0.1平台 。用86毫米内的直径进行采集 ，并用四通道
，冷冻，仅接收射频的射频线圈可积极地脱字的射频线圈
。轴向二维涡轮稀有（TR 2,500毫秒 ，TE 33毫秒
，两个平均值）16片式采集以0.6–0.8 mm的切片厚度进行，样品的样品约为256。信号是由2厘米直径的正交传输体积射频线圈（Rapid MR International）收到的 。成功的移植被定义为在移植半球中导致T2加权MRI信号连续区域的移植
。 　　用5％的异氟烷​​对大鼠进行诱导 ，在ASO注射过程中通过Cisterna Magna注射2-3％的异氟烷​​。将动物放在俯卧的位置
，脖子下方有一个小纸卷，向下倾斜头部 。脖子被剃光 ，用乙醇擦拭干净。为了靶向甲壳虫的麦克纳，通过触摸确定了孔的孔
，并在注射器上连接了27克针（BD，目录号305620） ，填充有300μgASO的ASO
，将其经常插入垂直于脖子的Cisterna magna中
。将针头固定在斜面向上，并将30μl的ASO慢慢注入水箱中。每只大鼠的过程少于2分钟 。在异氟烷诱导的10分钟内从麻醉中回收的动物
。在162–258天的T-HCO大鼠中进行ASO注射 ，并未蒙蔽。样本量通过经验估计 。 　　Rats were anaesthetized with isoflurane and brain tissue was removed and placed in cold (approximately 4 °C), oxygenated (95% O2 and 5% CO2) sucrose slicing solution containing 234 mM sucrose, 11 mM glu​​cose, 26 mM NaHCO3, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 10 mM MgSO4 and 0.5 mM CaCl2（大约310 MOSM）
。如前所述3
，使用LEICA VT1200纤维状质组将含有T-HCO的冠状大鼠脑切片（300–400μM）切片。然后在室温下将T-HCO切片移至连续氧化的切片室，其中含有ACSF（10 mm葡萄糖 ，26 mm Nahco3
，2.5 mm Kcl，1.25 mm NaHPO4 ，1.25 mm NAHPO4
，1 mm MGSO4，1 mm MGSO4 ，2 mm CACL2和2 mm CaCl2和126 mm NACL NACL（298 MOSM）） 。 　　将大鼠大脑与T-HCO进行解剖和切片后，将切片与NPC培养基1：1的Calbryte 520 AM（AAT BioQuest
，Aat Bioquest，目录No
。20650NO。20650）一起孵育45-60分钟 。Slices were then transferred to a 24-well imaging plate containing 500 μl of warm, low-potassium Tyrode’s solution (5 mM KCl, 129 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 30 mM glu​​cose, 25 mM HEPES pH 7.4) and imaged with a confocal microscope (Leica Stellaris) for 30 s at 37 °C, after which medium was replaced by高磷酸tyrode的溶液（High-kCl ，67 mm KCl：67 mm NaCl
，2 mM CaCl2，1 mM MGCL2 ，30 mm葡萄糖和25 mm HEPES pH 7.4）
，并恢复25分钟
。通过fiji（ImageJ v.2.1.0，NIH） ，从ROIS划定的Calbryte+ Somas（通过整个时间序列的标准偏差投影可视化）收集平均灰度值。将平均灰度值转化为荧光的相对变化：df/f（t）=（f（t）-f0）/f0
，其中f0代表每个ROI的时间序列的平均灰度值 。残留钙的计算为（c - a）/（b - a），其中b是去极化后的峰值（通过定制编织的matlab例程确定的最大峰值值（v。R2019b和v
。R2019b和v。R2022b ，9.4.0
，数学），A是基线值（B - 50th框架）和C是decay值（b - 50th框架）和B+150000000000 。 　　根据制造商的说明 ，使用FD Rapid Golgistain试剂盒（FD神经技术，PK401编号）进行高尔基染色
。简而言之
，将新鲜解剖的T-HCO与溶液A/B混合物在黑暗中孵育，然后转移到溶液中。将组织嵌入琼脂糖中 ，纤维状腔室填充了溶液C
，并使用Leica VT1200S vt1200s纤维状体填充溶液C和100μM的组织 。将切片安装在明胶涂层的载玻片上，在溶液D/E中染色 ，洗涤
，脱水，清除并覆盖
。图像是在带有Brightfield的SP8共聚焦显微镜上获取的。细胞根据其形态计算为神经元 。使用Neutube手动追踪树突
。迹象和分析均被视而不见。 　　数据表示为平均值±S.D.或平均±S.E.M.除非另有说明 。对原始数据的分布进行了测试 ，以确保分布的正态性
。使用两尾学生的t检验
，单向方差分析，具有多个比较 ，两尾Mann-Whitney测试或Kruskal-Wallis测试进行统计分析。统计分析是在Prism（GraphPad）中进行的 。除非另有说明
，否则在至少三个独立的生物学重复中重复了代表性实验的数据，结果相似。样本量通过经验估计
。 　　有关研究设计的更多信息可在与本文有关的自然投资组合报告摘要中获得。
http://http://www.o-press.com/news/show-363.html/sitemaps.xml http://http://www.0517kq.com/news/show-8151.html/sitemaps.xml http://http://www.o-press.com/news/show-332.html/sitemaps.xml http://http://www.o-press.com/news/show-139.html/sitemaps.xml http://http://www.o-press.com/news/show-237.html/sitemaps.xml http://http://www.0517kq.com/news/show-8264.html/sitemaps.xml http://http://www.o-press.com/news/show-352.html/sitemaps.xml http://http://www.o-press.com/news/show-274.html/sitemaps.xml http://http://www.0517kq.com/news/show-8391.html/sitemaps.xml http://http://www.o-press.com/news/show-29.html/sitemaps.xml